胃癌患者多種高通量譜表達數據聯合分析對相關基因篩選的臨床價值

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胃癌患者多種高通量譜表達數據聯合分析對相關基因篩選的臨床價值

李如凱1,郭龍華2

(1.深圳市寶安區石巖人民醫院 檢驗科,廣東 深圳518108;2.深圳市龍華新區人民醫院 檢驗科,廣東 深圳518109)

胃癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，占據所有的惡性腫瘤中較高的比例，為當前危害人類生命健康的主要疾病之一。現在，在臨床上仍然沒有明確的胃癌發病機制，很多學者認為，胃癌的產生為多基因參與并且是不斷積累的過程，其中涉及到癌基因、生物因子的受體、微衛星的不穩定以及細胞周期的調控等諸多改變[1]。對胃癌發病機制的深入認識有助于提高胃癌的臨床診斷率，為疾病的進一步治療提供重要依據。本文主要以我院2010年1月至2013年12月50例胃癌患者的胃鏡活檢標本為研究對象，分析了采取多種高通量譜表達數據聯合分析并篩選胃癌相關基因的臨床應用價值。具體操作如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

回顧性分析選取我院2010年1月至2013年12月50例胃癌粘膜組織胃鏡活檢標本。正常胃粘膜組織50例。取樣后迅速置于液氮中備用。

1.2　數據分析與RT-PCR方法

采用vNorthern篩查10個已知胃癌基因。在這其中應用了腫瘤基因的解剖工程(CGAP)它的數據庫中根據EST數據的SAGE-Digital Gene Expression Displayer(SAGE DGED)以及cDNA-Digital Gene Expression Displayer (cDNA DGED)來進行篩查有胃癌的組織和正常的胃組織中的差異表達基因，將上述篩選出的基因進行SAGE vNorthern和EST vNorthern比對，選取在SAGE vNorthern和EST vNorthern數據庫中在胃癌組織和正常胃組織中表達具有統計學差異的基因，與SMD數據庫中胃癌微陣列表達譜數據進行對比分析，最后選取4個候選胃癌差異基因，采用RT-PCR法進一步在胃癌組織和正常胃組織共100例中進行驗證。

1.3　統計學方法

2結果

2.1　對于利用vNorthern篩查胃癌相關基因的可行性分析

采用vNorthern篩查包括PGC、bcl-2、c-met、c-myc、PCNA、GDDR、P53、TFF2、Ha-ras、E-cadherin10個已知胃癌基因。其中：PGC、PCNA、P53、c-met、c-myc、Ha-ras在胃癌組織中表達高于正常組織，E-cadherin在正常組織中表達高于癌組織。GDDR、TFF2幾乎僅在正常胃組織中表達。我們發現，在vNorthern分析數據中，個別基因在部分組織中表達情況和數據不符，可能與該數據庫收錄數據情況有關。

2.2　數據庫cDNADGED和SAGEDGED胃癌差異表達基因篩查

2.2.1cDNADGED胃癌差異表達基因篩查

cDNADGED中進行分析發現胃癌和正常胃組織表達相差≥2倍的基因(前10個)，見表1。從cDNADGED中抽取100個以上的序列文庫，共對比了142個cDNA的文庫，在這其中有胃癌組98個,包括111042個序列，而正常組有44個，共有27889個序列。運用cDNADGED工具進行分析，結果具有大于2倍差異水平統計學的意義(P<0.05)的基因247個，其中胃癌組織中高表達的基因92個，低表達的基因155個。

2.2.2SAGEDGED胃癌差異表達基因篩查

SAGEDGED中進行分析發現胃癌和正常胃組織表達相差≥2倍的基因(前10個)，見表2。分析過7個胃組織的短序列標簽的SAGE文庫，其中有300741個短序列的標簽，胃癌組有4個SAGE文庫其中包括短序列的標簽有249310個，而正常組中3個SAGE文庫就有短序列標簽共51431個。通過DEGD工具的分析，結果顯示共有196個標簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統計學意義，在這196個標簽中有69個基因有胃癌組的高表達,還有127個低表達基因。

表1　　cDNADGED中進行分析發現胃癌和正常胃組織

2.3　利用vNorthern來對SAGE DGED以及cDNA DGED進行篩查出胃癌的差異還有表達基因的進一步比對分析

表2　SAGE DGED中進行分析發現胃癌和正常胃組織

通過SAGE vNorthern和EST vNorthern對DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進行比對，共篩選出的基因在ESTvNorthern及SAGE vNorthern數據中有38個都有統計學的意義，P<0.05，部分見表3。

表3　vNorthern分析和胃癌組織和正常胃組織部分差異基因

2.4　利用SMD數據庫中胃組織微陣列數據結合vNorthern篩查基因進一步比對

將vNorthern篩選得到的38個基因和在SMD數據庫中的微陣列的胃組織進行數據對比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經過對比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個，正常胃組織見表4。

2.5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達分析

ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達分析，見表5。在胃癌組織中，ANXA1的表達顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達顯著低于正常胃組織，P<0.01。

表4　v Northern分析和virtural micrroarray分析共同

表5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和

3討論

至今，在臨床上胃癌還沒有一個明確的發病機制，大多數的學者認為，多基因的參與并且逐漸積累就會形成胃癌，其中涉及到細胞周期調控、癌基因、生長因子的受體、微衛星的不穩定等諸多改變[2]。對胃癌發病機制的深入認識有助于提高胃癌的臨床診出率，為疾病的進一步治療提供重要依據。近年來，在臨床上對胃癌的發病機制加大了研究的力度，并且還得到了一定的進展。

cDNA文庫以芯片技術為基礎，是當前運用較普遍的一種數據庫，當前主要芯片數據庫包括ArrayExpress數據庫、基因表達匯編以及斯坦福微陣列數據庫[3]。但是由于芯片技術發展時間較短，所傳遞的信息量有限[4]。在實際運用中，具有較高的假陽性率，在腫瘤基因的檢測中具有一定的局限性[5]。SAGE文庫是一種以SAGE技術為基礎的表達譜數據庫。在實際運用過程中，SAGE文庫要求的測序次數較少，在低豐度的轉錄本信息的檢測中，具有較高的靈敏度[6]。相關研究表明[7,8]，SAGE數據庫在胃癌腫瘤差異表達基因的篩選中具有較高的應用價值。總之，高通量譜表達數據技術的原理不同，其在腫瘤基因篩選中的敏感性也各不相同，因此，對于胃癌患者胃癌相關基因的篩選可以聯合應用不同種類的高通量譜表達數據技術，以提高數據庫信息挖掘的準確性，極大程度上降低篩選假陽性率，提高胃癌的診斷準確性[9]。

本研究通過對100例胃癌患者的活檢標本采取多種高通量譜表達數據聯合分析并篩選胃癌相關基因，結果顯示，v Northern數據分析能篩選出胃癌相關基因。在cDNA DGED中抽取了100個以上的序列文庫，總共對比的cDNA文庫有142個，其中胃癌組患者有98個,這其中包括了111042個序列，而正常組有44個，總共有27889個序列。通過采用cDNA DGED工具的分析，結果顯示共有247個基因大于2倍差異水平并且具有明顯的統計學意義，這其中包括有92個高表達的胃癌組織，還有155個基因是低表達，表明cDNA文庫能有效地篩選胃癌相關基因。分析了SAGE文庫中的7個胃組織短序列的標簽，其中共有短序列標簽300741個，胃癌組中4個SAGE文庫總共包括249310個短序列標簽，在正常組中3個SAGE文庫總共有51431個短序列標簽,。通過運用DEGD工具進行分析，結果顯示共有196個標簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統計學意義，其中胃癌組高表達的基因69個,低表達的基因127個，表明SAGE文庫有效地篩選胃癌相關基因。此外，利用SAGE vNorthern和EST vNorthern對DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進行比對，在ESTvNorthern以及SAGE vNorthern數據中都具有統計學意義的基因共有38個，P<0.05。將通過vNorthern篩選得到的38個基因和SMD數據庫中的胃組織微陣列進行數據對比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經過對比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個。在胃癌組織中，ANXA1的表達顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達顯著低于正常胃組織，表明SAGE vNorthern和EST vNorthern有效地篩選胃癌相關基因，這個結果于相關文獻所報道的數據是相吻合的[10]。

參考文獻：

[1]Ting,Peng Hongzheng.Characterization and expression patterns of microRNAs involved in rice grain filling[J].PloS one,2013，8(1):442.

[2]劉振華.利用高通量基因芯片建立與分析單側隱睪癥睪丸基因表達譜 [J].中華男科學雜志,2013，19(2):56.

[3]Yepeng,Sun Fawei.Transcriptome exploration in Leymus chinensis under saline-alkaline treatment using 454 pyrosequencing[J].PloS one,2013，8(1):66.

[4]張明霞,陳心春 .高通量測序技術分析肺結核患者PBMC基因表達譜差異[J].中國免疫學雜志,2013，29(6):43.

[5]路新華,李韶菁.白介素-1β轉化酶抑制劑的高通量篩選[J].中國抗生素雜志,2011，36(5):1991.

[6]龔汶.原癌基因Pokemon在原發性肝癌患者外周血中的表達及意義[J].中西醫結合肝病雜志,2013，23(4):12-.

[7]丁士剛,王麗.應重視胃癌發病機制的規范研究[J].中華醫學雜志,2013，93(16):113.

[8]張帆,袁耀宗.幽門螺桿菌相關胃癌與微小核糖核酸的研究進展[J].中華消化雜志,2013，33(05):4.

[9]潘晟,羅浩,李力.胃癌變患者c-myc mRNA與幽門螺桿菌感染及細胞程序性死亡的關系[J].中華實驗外科雜志,2013，30(11):89.

[10]盧建華,龐彥超,陳劍英.LAMA-3基因在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J].中華實驗外科雜志,2013，30(11):58.

(收稿日期：2014-05-27)

文章編號：1007-4287(2015)07-1166-03