CKS1siRNA聯合化療藥物對舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白表達影響的研究

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CKS1siRNA聯合化療藥物對舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白表達影響的研究

徐亞娟1,李兆東2,高元奇2,張叢笑3,倫志軍3,畢崇才3,劉文書3*

(1.吉林省腫瘤醫院,吉林 長春130012；2.吉林大學基礎醫學院,吉林 長春130021；

3.吉林大學第一醫院,吉林 長春130021)

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，治療效果不理想。目前，舌癌的治療主要是以手術和放、化療為主[1]，其中化療是目前有效綜合治療舌癌的一個重要的方法，但化療藥物的應用存在耐藥和毒副作用等，限制了其用量和時間[2,3]。近年來的研究表明[4]，腫瘤的發生、發展是細胞周期調控因子異常導致的細胞周期紊亂，因此，尋找有關的調控因子，并將其作為目的基因與放化療相結合，對腫瘤治療具有重要意義。

CKS1是細胞周期蛋白依賴性激酶的亞基，能與其他細胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結合，參與細胞周期調控，與腫瘤的發生、發展密切相關[5]。現在的研究擬通過CKS1 siRNA轉染Tca8113細胞并加用化療藥物，以觀察CKS1 siRNA對化療藥物的增效作用。

1材料與方法

1.1　實驗材料

人舌癌Tca8113細胞系購自北京博楓科生物科技有限公司，DMEM培養液(上海碧云天生物技術有限公司)。平陽霉素(哈爾濱萊博通藥業有限公司)，順鉑(山東羅欣藥業股份有限公司)，氟尿嘧啶(修正藥業集團股份有限公司)，長春新堿(浙江海正藥業股份有限公司)，胰蛋白酶(蘇州新寶制藥有限公司)。

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養人舌癌Tca8113細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基在5% CO2、37℃細胞培養箱中培養。細胞生長至90%匯合時，用0.25%胰酶(含1% EDTA)消化，經離心后制成單細胞懸液，以1∶4比例傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2CKS1 siRNA 轉染CKS1 siRNA有意義鏈：5’-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3’；對照鏈：5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’由上海GenePharma公司合成，同時對siRNA序列進行2'Ome修飾(穩定化學結構)和5'FAM修飾(綠色熒光)，具體實驗操作嚴格按GenePharma siRNA-MateTM和siRNA-MateTM轉染試劑盒進行。

1.2.3化療藥物對Tca8113細胞的作用將Tca8113細胞培養于96孔板，細胞分為：空白組、轉染組、平陽霉素組、順鉑組、氟尿嘧啶組、長春新堿組、平陽霉素+siRNA組、順鉑+siRNA組、氟尿嘧啶+siRNA組、長春新堿+siRNA 組共10組，每組3個復孔。細胞以每孔5×103個接種于96孔培養板，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養24 h。轉染組和轉染聯合化療藥物組細胞先進行CKS1-siRNA轉染，濃度為10 nM；其他各組正常培養。24 h后，藥物組分別加入4種藥物，具體濃度梯度按表1進行。

表1　4種化療藥物的配制濃度

加藥后繼續在37℃、5% CO2培養箱中培養48 h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37℃孵育4 h，棄培養液后再加入150 μl DMSO，震蕩10 min，于酶標儀(490 nm波長)測定各孔吸光值(OD值)，計算抑制率并根據公式計算轉染前后各組細胞的半致死量(IC50)，同時根據半致死量的值用于后續實驗。

1.2.4化療藥物對轉染后Tca8113細胞的CKS1蛋白表達水平檢測細胞培養及操作方法同前。然后收集細胞，提取蛋白質并對蛋白質進行定量和變性，通過常規SDS-PAGE和Western blot對轉染后給予不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白表達進行檢測。

2結果

2.1　轉染前后4種化療藥物對Tca8113細胞的半數致死量

實驗結果如表2所示，轉染CKS1 siRNA后，各化療藥物對Tca8113細胞的半致死劑量明顯低于未轉染組，其中以順鉑組差異更明顯。

2.2　轉染后4種化療藥物對Tca8113細胞CKS1蛋白表達水平的影響

圖像經Imagej軟件分析灰度值，進行半定量分析。各組之間的比值差異2倍以上認定為有顯著性差異。實驗結果如表3、圖1所示，轉染后再加入4種不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白水平顯著下降，與對照和轉染siRNA組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中，藥物聯合siRNA協同作用對CKS1蛋白水平影響的強度由弱到強依次為：氟尿嘧啶聯合siRNA，平陽霉素聯合siRNA，長春新堿聯合siRNA，順鉑聯合siRNA。

表2　轉染前后四種化療藥物對Tca8113細胞的

表3　藥物聯合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

—：轉染脂質體的對照組； N：轉染siRNA組； Cks：Cks1 siRNA轉染組；1：順鉑聯合siRNA組；

2：平陽霉素聯合siRNA組；3：長春新堿聯合siRNA組；4.氟尿嘧啶聯合siRNA組

圖1藥物聯合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

3討論

惡性腫瘤的目前基因治療有如抑癌基因的附加、癌基因的抑制等[6],但由于腫瘤發病的多基因和多因素等原因，使基因治療的應用受到限制。因此，將抗腫瘤相關基因與現在治療方法相結合使其能更好地發揮療效，是提高化療藥物對舌癌的敏感性的一個重要途徑。

2001年Ganoth等[7]首次發現cks1蛋白具有促進p27蛋白泛素化降解功能。P27被認為是一種抑癌基因。此外還具有調節腫瘤的耐藥、促進凋亡、誘導分化等作用。張秀梅等[8]應用免疫組化和流式細胞術對肝癌和胃腺癌中的CKS1及CKS1、P27蛋白進行檢測，發現在腫瘤中CKS1的表達增高，P27的表達降低，且與淋巴結的轉移、浸潤程度等有關。最近研究發現[9]，CKS1對細胞周期各個時相G1、S、G2、M期都有作用，其可能促進G2/M期的細胞周期激酶抑制劑P27的集聚。本研究結果提示，轉染后細胞的半數致死劑量明顯低于轉染前，藥物聯合siRNA轉染的Tca8113細胞的CKS1蛋白表達顯著下降，表明藥物聯合siRNA轉染可有效抑制CKS1蛋白表達，可能通過防止p27蛋白泛素化降解，抑制腫瘤發展。為應用CKS1 siRNA治療舌癌的研究提供了進一步實驗的證據。

參考文獻：

[1]You YH,Chen WL,Wang YP,et al.Reverse facial-submental artery island flap for the reco nstuction of Maxillary defects after cancer abcation[J].J Craniofac Surg,20009,20(6):2217.

[2]張書怡，陳永輝.VDP方案術前誘導化療治療舌癌的近期療效觀察[J].齊齊哈爾醫學院學報，2011,32(12)：1900.

[3]汪躍平，游云華，梁軍，等.順鉑-碘化油懸乳膠液經數字減影血管造影舌動脈栓塞化療對晚期舌癌的臨床病理分析[J].中華臨床醫師雜志，2010,4(9):1658.

[4]詹啟敏，陳杰．細胞周期與腫瘤轉化醫學[J].中國腫瘤臨床，2014,41(1)：1.[5]陳紫萱，黃如欣，張忠英，等.CKS1蛋白在惡性腫瘤中的研究進展[J].檢驗醫學與臨床，2009,6(9)：705.

[6]武媛，張壯，潘劍.Rac1基因RNAi慢性病毒載體的構建與鑒定[J].中國組織工程研究，2012,16(20)：3763.

[7]Ganoth D,Boinstein G,Ko T,et al.The cell-cycle regulatory protein cks1 is required for SCF skp2-mediated ubiquitinylation[J].Nat Cell Biol,2001,3(3):321.

[8]張秀梅，顧金松，劉曙，等.老年肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤外科雜志，2013,5(4)：239.

[9]Hoellein A,Graf S,Bassermann F,et al.Cks1 promotion of S phaseentry and proliferation is dependent of p27kip1 suppression[J].Mol cell Biol,2012,32(13):2416.

(收稿日期：2015-02-08)

文章編號：1007-4287(2015)07-1054-03

*通訊作者

基金項目:吉林省發展和改革委員會資助(JF2012C006-8)