MMP-2、MMP-9對腦缺血再灌注大鼠緊密連接蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究

辛浩琳　郭　娜　徐忠信

1　天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　300211;　2　撫順市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；　3　吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

MMP-2、MMP-9對腦缺血再灌注大鼠緊密連接蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究

辛浩琳1郭娜2徐忠信3

1天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科300211;2撫順市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

溶栓治療被認(rèn)為是急性腦梗死最有效的治療方法之一。然而，再灌注損傷的出現(xiàn)可引起血腦屏障通透性發(fā)生變化, 直接導(dǎo)致血管源性腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。緊密連接(Tight junction，TJ)是血腦屏障的重要結(jié)構(gòu)組件，在限制細(xì)胞旁通透性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，與血腦屏障通透性密切相關(guān)，其中claudin-5和occludin尤為重要。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員。MMP-2和MMP-9可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血腦屏障破壞，與再灌注損傷密切相關(guān)。而腦缺血再灌注過程中，影響緊密連接蛋白(Tight junction protein，TJPs)變化的相關(guān)分子機(jī)制目前尚不完全明了。因此，本研究將探討在再灌注過程中，MMP-2和MMP-9的激活是否參與claudin-5和occludin蛋白的降解，從而影響血腦屏障通透性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SD大鼠，鼠齡3~5個月，體重280~320g，隨機(jī)分為：假手術(shù)組(Sham)、再灌注3h組(3h RP)、再灌注3h MMPs抑制劑組(3h RP/GM6001)：將MMPs抑制劑GM6001溶解于1%DMSO中，5μg/只，2μl，MCAO前15min通過CCA給藥。在每個再灌注時間點(diǎn)結(jié)束時，大鼠被斷頭處死。用鑷子分別取出非缺血側(cè)(Non-I)及缺血側(cè)(I)的紋狀體組織，用于檢測。

1.2主要儀器與試劑BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TritonX-100，北京索萊寶科技有限公司；明膠，北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜，Millipore公司；兔抗大鼠claudin-5多克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology；兔抗大鼠occludin多克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology；山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；GAPDH內(nèi)參抗體，上海康成生物工程有限公司。

1.3Western blot樣品從紋狀體組織中提取并與含有1%的苯甲基磺酰氟的放射免疫測定裂解緩沖液混合。分離40μg蛋白在聚偏二氟乙烯膜上進(jìn)行電印跡。聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂乳/Tris緩沖鹽水吐溫-20(pH 7.6)封閉2h，然后加入多克隆兔抗claudin-5，兔抗occludin孵育，小鼠抗-GAPDH。將聚偏二氟乙烯膜與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體在室溫孵育1h。隨后通過化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法測定，掃描及分析聚偏氟乙烯膜。條帶吸光度值計(jì)算claudin-5 / GAPDH或occludin/GAPDH的比率。

1.4明膠酶譜法將紋狀體組織在含有1%苯甲基磺酰氟的PBS中勻漿成單細(xì)胞懸浮液，并用液氮凍融。等量樣品(80μg)通過電泳分離，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠與1mg/ml明膠共聚。將凝膠在含2.5% Triton X-100、50mM Tris- HCl、5mM CaCl2、1μM ZnCl2溶液、pH7.6，洗滌2次，40min。洗滌后的凝膠用含有50mM Tris-HCl、5mM CaCl2、1μM ZnCl2溶液沖洗，pH7.6，洗滌2次，20min。然后將凝膠與含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)、5mM CaCl2、1μM ZnCl2、0.02%(w/v)NaN3，在37℃進(jìn)行40h孵育。用含有10%(v/v)乙酸和30%甲醇，在0.05%考馬斯藍(lán)R-250溶液中染色30min。用A、B、C溶液將凝膠染色，直到在背景出現(xiàn)清晰條帶。通過使用Gelatum分析系統(tǒng)的測定進(jìn)行分析72kDa、92kDa的吸光度值分析MMP-2、MMP-9活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件處理。定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述采用mean±SEM表示，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett’s檢驗(yàn)，以P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MMP-2，MMP-9活性測定如圖1所示(A、B、C)，再灌注3h組大鼠，與Sham組相比，在缺血側(cè)和非缺血側(cè)，72kDa MMP-2表達(dá)顯著增加(P<0.05)；在缺血側(cè)，92kDa MMP-9少量表達(dá)，但相對于非缺血側(cè)，明顯增加(P<0.05),但MMP-2條帶增加更加明顯。MMPs抑制劑GM6001，均顯著抑制MMP-2、MMP-9的活性(P<0.05)。

圖1　明膠酶譜法顯示各組大鼠紋狀體組織MMP-2、MMP-9活性

注：A ：MMP-2，MMP-9活性的電泳圖；B： MMP-2條帶光密度值比較；C：MMP-9條帶光密度值比較；*與Sham組相比P<0.05；#與3h RP/Non-I側(cè)相比P<0.05；Δ與3hRP組相比P<0.05。

2.2MMPs抑制劑對claudin-5、occludin蛋白降解影響如圖2A、B所示，再灌注3h，缺血側(cè)22kDa claudin-5蛋白水平顯著降低(P<0.05)，17kDa的claudin-5片段在缺血側(cè)顯著增加(P<0.05)，表明claudin-5分子降解。在缺血側(cè)，GM6001治療阻止了claudin-5的降解(22kDa) (P<0.05)。

如圖2A、C所示，再灌注3h，在缺血側(cè)65kDa occludin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，分子量為60kDa occludin蛋白片段顯著增加；而GM6001治療顯著逆轉(zhuǎn)缺血側(cè)occludin蛋白的表達(dá)減少，并同時抑制雙側(cè)60kDa條帶出現(xiàn)(P<0.05)。

圖2　MMPs抑制劑對claudin-5，occludin降解影響

注：A： claudin-5、occludin免疫印跡圖片；B： claudin-5(22kDa、17kDa)相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C：occludin(65kDa、60kDa)相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*與Sham組相比P<0.05；#與3hRP組相比P<0.05。

3討論

MMPs是公認(rèn)的與BBB損害有關(guān)的效應(yīng)分子[1]。MMP-2和MMP-9是其家族中的重要成員，既往研究表明，MMPs已經(jīng)牽涉腦缺血的病理生理改變，因?yàn)樗麄兛梢詫?dǎo)致BBB的破壞，與腦水腫形成和HT密切相關(guān)[2~4]。

微血管ECs是形成BBB的解剖學(xué)基礎(chǔ)，BBB結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與ECs之間TJ復(fù)雜結(jié)構(gòu)，TJPs表達(dá)的變化有關(guān)。其中，claudin-5、occludin是公認(rèn)的直接參與調(diào)節(jié)BBB完整性和保持BBB功能穩(wěn)定的基礎(chǔ)[5,6]。

在本研究中，缺血側(cè)腦組織分泌的主要明膠酶是MMP-2。MMP-2活性增加與缺血性腦損傷的啟動相關(guān)[7]。GM6001是一種廣譜的肽肟酸類MMPs抑制劑，可與MMPs的活性部位結(jié)合，抑制proMMPs轉(zhuǎn)化為活化形式的MMPs[8，9]。明膠酶譜法顯示，在再灌注3h組，GM6001治療組與假手術(shù)組相比，表現(xiàn)出較小的MMP-2和MMP-9水平。這些結(jié)果表明，MMPs抑制劑的使用，確實(shí)抑制了MMP-2、MMP-9的產(chǎn)生。

MMPs抑制劑GM6001通過抑制MMPs介導(dǎo)的claudin-5、occludin蛋白在BBB微血管降解保持TJ的完整性。總之，這些研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，MMPs，特別是MMP-2，介導(dǎo)claudin-5、occludin降解是早期BBB損傷的一個重要機(jī)制。

TJPs是一組膜蛋白，在維持BBB結(jié)構(gòu)和功能完整性方面起著重要的作用。再灌注3h，MMPs活化引起TJPs降解，導(dǎo)致claudin-5和occludin連續(xù)性及穩(wěn)定性的變化，與MMP-2激活和表達(dá)相關(guān)。TJPs可能松動，但仍可能停留在微血管ECs之間的裂隙，并出現(xiàn)部分降解或者斷裂。而BBB開放，是瞬態(tài)和可逆的開放，MMPs抑制劑使用可恢復(fù)TJ結(jié)構(gòu)完整及功能恢復(fù)。在這以后，如果更具破壞性的損傷因素被阻止，TJ將繼續(xù)保持其完整性。可見，MMPs抑制劑的有益作用，可以阻止TJ開放這一進(jìn)程。

這項(xiàng)研究提供了MMPs抑制劑作用的分子基礎(chǔ)。在急性缺血性腦卒中，針對MMPs的聯(lián)合治療，可能會限制rt-PA的神經(jīng)毒性。這其中卻需要更好地理解MMPs降解TJPs機(jī)制，而MMPs抑制劑合成的前景，在于控制ECM蛋白的損害，包括基底層和TJPs。

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(編輯落落)

●致作者●

本刊對稿件中圖、表的要求

每幅圖、表應(yīng)有言簡意賅的題目。本刊采用三線表(頂線、表頭線及底線)，表中若有需說明的事項(xiàng)(如P值)可在表中相關(guān)內(nèi)容的右上角標(biāo)注“*”、“Δ”等，并在表下加以注釋。要合理安排縱表的橫標(biāo)目，并將數(shù)據(jù)的含義表達(dá)清楚；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)保留的小數(shù)位數(shù)相同，同一欄數(shù)字必須按位次上下對齊。圖不宜過大，最大寬度半欄圖不超過7．5cm，通欄圖不超過16.5cm，高與寬的比例應(yīng)掌握在5∶7左右。線條圖可墨繪在白紙上，或用制圖軟件繪制，并提供激光打印圖樣；圖的類型應(yīng)與資料性質(zhì)匹配，并使數(shù)軸上刻度值的標(biāo)法符合數(shù)學(xué)原則。照片圖要求有良好的清晰度和對比度。圖中需標(biāo)注的符號(包括箭頭)請另用紙標(biāo)示，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號、作者姓名及圖的上下方向，圖片不可折損。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部位。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。引用已發(fā)表的圖需注明出處，并附版權(quán)所有者同意使用該圖的書面材料。

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摘要目的：本研究將探討在再灌注過程中，MMP-2和MMP-9的激活是否參與claudin-5和occludin蛋白的降解。方法：選取再灌注3h這個再灌注時間點(diǎn)進(jìn)行研究。通過明膠酶譜法，確定MMPs的活性來源；通過Western blot測定claudin-5，occludin在缺血側(cè)、非缺血側(cè)蛋白水平；通過使用MMPs抑制劑GM6001，進(jìn)一步驗(yàn)證明膠酶(MMP-2和MMP-9)在腦缺血再灌注過程中對claudin-5和occludin蛋白降解的影響。結(jié)果：再灌注3h，明膠酶譜法顯示MMP-2比MMP-9有較大的增幅。可見，在再灌注3h,MMP-2是最主要的酶源。在缺血側(cè)，可見claudin-5和occludin蛋白降解片段。MMPs抑制劑GM6001使用可以完全抑制缺血側(cè)及非缺血側(cè)MMP-2和MMP-9的活性，并抑制claudin-5和occludin蛋白的降解。結(jié)論：MMP-2和MMP-9介導(dǎo)的claudin-5和occludin蛋白降解是與再灌注損傷相關(guān)的血腦屏障破壞的一個重要機(jī)制。

關(guān)鍵詞MMP-2MMP-9claudin-5occludin腦缺血再灌注

Experimental Study of MMP-2,MMP-9 Affect on Tight Junction Proteins in Cerebral Ischemia-reperfusion Rats

XIN Haolin*，GUO Na,XU Zhongxin.*DepartmentofNeurosurgery,TianjinHuanhuHospital，TianjinCity300211

ABSTRACTObjective:In this study,we are interested in whether the activated MMP-2 and MMP-9 are involved in the degradation of claudin-5 and occludin proteins.Methods:First,by gelatin zymography,we quantified the activities of MMP-2 and MMP-9 in the brain of rats subjected to 2h of middle cerebral artery occlusion followed by 3h of reperfusion.Then,we future investigate the role of MMP-2 and MMP-9 activation in the degradation process of claudin-5 and occludin proteins. Finally,using MMPs inhibitor GM6001, we further study and verify the effect of gelatinases on the degradation of claudin-5 and occludin proteins after 3h of reperfusion.Results:Gelatin zymography showed greater increases in MMP-2 than in MMP-9.MMP-2 was the main enzymatic source at 3h reperfusion.claudin-5 and occludin expression decreased at 3h in both hemispheres, with fragments of both proteins seen in the blots at 3h on the ischemic side.MMPs inhibitor GM6001 completely blocked gelatin cleavage by the improved activities of MMP-2 and MMP-9,and prevent the degradation of claudin-5 and occludin proteins during the early stage of cerebral ischemia reperfusion, respectively.Conclusion:Our study suggests that MMP-2 and MMP-9 mediated degradation of the claudin-5 and occludin proteins may represent an important mechanism for reperfusion-associated BBB disruption.

KEY WORDSMMP-2,MMP-9,claudin-5,occludin

收稿日期2014-11-23

中圖分類號：R-33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)07-0841-03