復制慢性高原病動物模型實驗教學中注意事項分析

李曉栩，黃 瑊，楊誠忠，譚小玲，蔡明春，崔中來，官立彬

（第三軍醫大學高原軍事醫學系高原生理學與高原生物學教研室/教育部高原醫學重點實驗室和全軍高原醫學重點實驗室，重慶400038）

復制慢性高原病動物模型實驗教學中注意事項分析

李曉栩，黃 瑊，楊誠忠，譚小玲，蔡明春，崔中來，官立彬

（第三軍醫大學高原軍事醫學系高原生理學與高原生物學教研室/教育部高原醫學重點實驗室和全軍高原醫學重點實驗室，重慶400038）

該文主要介紹實驗教學中高原紅細胞增多癥合并高原心臟病動物模型復制的方法和注意事項，通過模型的復制，以及對存在的具體問題和注意事項的逐步剖析，使學生全面了解實驗方法和取材方法，在實驗前熟悉低壓艙使用、動物飼養及動物取材注意事項，為學生提供一個標準化的模型復制程序，使復制高原紅細胞增多癥合并高原心臟病的動物模型更加穩定，降低動物的死亡率，提高模型復制的成功率，確保模型復制過程中進艙人員的安全。

高海拔； 高原病； 模型，動物； 大鼠； 實驗教學

慢性高原病（chronicmountain sickness，CMS），國際上習慣稱為慢性高山病，是高原地區危害人體健康的常見慢性病，分為高原紅細胞增多癥、高原心臟病、高原血壓異常、高原衰退癥，國際上統一應用青海標準作為其診斷標準[1-3]。CMS主要發生在長期生活工作在海拔3 000m以上的人群，其發病機制與高原低氧有直接關系[4-5]。高原紅細胞增多癥合并高原心臟病動物模型是研究CMS的一種常用的實驗模型，但目前動物選擇、模型復制方法（缺氧方法、缺氧時間和海拔高度）尚不統一，而且實驗中的取材方法對實驗結果的影響報道甚少，而選擇合適的實驗動物和模型復制方法是教學科研成功的關鍵。

在實驗教學中，教師通常采用低壓低氧動物實驗艙模擬海拔5 000m復制大鼠高原紅細胞增多癥合并高原心臟病模型。本文通過對實驗過程和多次的大鼠解剖觀察，模型制備過程的關鍵環節的分析，總結出一套實驗準備，模型復制和取材的注意事項。希望學生在教學實踐過程中通過對各環節影響因素的了解，達到提高模型復制的成功率，降低動物模型復制中的死亡率，順利完成實踐教學的目的，為以后進行規范化的教學科研奠定基礎。

1 教學內容

1.1 儀器與試劑 10%烏拉坦，肝素，生理鹽水，紅細胞稀釋液，血紅蛋白測定試劑盒，蒸餾水，顯微鏡，動脈導管，靜脈導管和大鼠鼠臺。

1.2 實驗方法 將SD大鼠分為平原組和缺氧組，缺氧大鼠組置于低壓艙內，以200m/min速度上升至模擬海拔5 000m，進行連續缺氧28 d，每48小時進入過渡艙為大鼠添加食物、水及打掃衛生，平原組大鼠放于另一低壓艙內，在平原環境下飼養28 d。

1.3 動物取材 缺氧28 d后，進行取材。缺氧組在模擬海拔4 000m下進行取材，平原組則在平原環境下進行。首先，使用10%烏拉坦，1mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，自大鼠右側頸外靜脈插入聚乙烯塑料微導管，導管另一側連接壓力傳感器，用多導生理記錄儀記錄平均肺動脈壓（mPAP）及右心室壓力（RVP）、與右心室內壓變化速率等，待記錄完畢后，抽取大鼠動脈血測定血氣，對紅細胞進行計數，再加入1mL全血置于血球比積管中，3 000 r/min離心15min，測量血球壓積，根據血紅蛋白測定試劑盒說明書測定血紅蛋白，采血后快速打開胸腔取出大鼠心臟，去掉心房，沿室間隔邊緣小心分離右心室（RV）和左心室（LV）+室間隔（S），用生理鹽水漂洗2~3遍后，用濾紙吸干水分后稱量RV和LV+S的質量，以RV/（LV+S）和RV/BW（體質量）反映RV肥厚程度。

2 注意事項

2.1 低壓艙使用注意事項

2.1.1 確保進倉人員的安全 進入低壓艙的學生必需身體健康，患有嚴重的心血管疾病、呼吸系統疾病或感冒者勿入。進入低壓艙前，學生必須熟悉低壓艙的使用規則，了解艙內設施情況，如通訊設施、遞物艙、吸氧設備的位置，并由專業人員對通訊，遞物艙，吸氧設備的使用方法進行培訓。在低壓艙模擬開始時再次檢查吸氧設備的工作情況。另外，為了確保學生在艙內的安全，禁止單人進入。由于在上升過程中外界壓力迅速降低，而中耳內壓力高，容易導致中耳脹氣，引起耳部不適，因此學生在上升過程中應進行適當咀嚼活動，而在下降過程中，外界壓力迅速增高，而中耳內壓力低，容易導致耳膜壓痛，甚至穿孔，因此學生在下降過程中應進行咽鼓管充氣。若發生高原反應，如心率過快、頭痛劇烈、耳鳴等不適癥狀，應迅速吸氧并聯系艙外工作人員，降至平原。

2.1.2 動物飲水瓶灌裝的注意事項 低壓艙在上升過程中，由于外界壓力變化，會導致動物飲水瓶中的水不斷滴入動物籠中，如果滴水過多，動物籠中則會過于潮濕，會導致病原微生物和寄生蟲的過度繁殖，墊料和飼料易發生霉變，不利于大鼠的健康，易造成大鼠的死亡。因此，在進行減壓前，應該完全灌滿全部飲水瓶，減少滴水的發生。

2.2 動物飼養注意事項

2.2.1 實驗動物 高原紅細胞增多癥合并高原心臟病模型復制常選用健康成年SD大鼠，清潔型，體質量180~ 220 g，6~10周齡，體質量過輕將增加實驗動物模型復制過程中的死亡率，體質量過重影響因素將增多，影響模型復制的穩定性。在性別選用上，應盡量選擇雄性動物或雌雄各一半進行缺氧模型制作。有研究表示，雌性動物可分泌雌激素，而雌激素有顯著的抗缺氧作用，降低模型復制的成功率[6-8]。此外，動物領回后須在平原環境適應性飼養1周，方可進行低壓缺氧實驗。

2.2.2 動物飼養 平原組和缺氧組大鼠均應在相同環境下飼養，溫度為（22.0±3.5）℃，濕度為（50±10）%，明暗交替為12 h∶12 h，飼料、墊料經高壓滅菌，飲水為冷開水。夏季須每天更換墊料，冬季每周更換3次，冬季還應注意保暖。飼養間應保持干燥、無嘈雜。環境溫度、濕度等的不適均會導致大鼠心情煩躁易怒，影響模型復制的成功率。模型復制期間，所有進艙換水換料均不能降至平原環境進行，否則將引起動物缺氧-復氧-再缺氧循環，造成氧化應激損傷，導致模型復制的失敗。低壓艙環境密閉，需要經常觀察動物情況，大鼠低壓缺氧后，前7天內食量會顯著下降，體質量降低，也是動物模型復制過程中死亡的高峰期，應重點觀察，避免動物死亡后尸體的腐臭味影響環境。另外，還應重點保證飲水的供給。

2.3 動物取材注意事項 取材前大鼠需禁食12~18 h，時間過長會增加大鼠的死亡率，時間過短達不到禁食效果，此時還應給予充足的飲水。取材時，大鼠麻醉后進行插管，插管結束后，動物取材應盡快完成，夏季通常在動物死后4 h內完成，時間過長，組織容易變性、腐敗，影響實驗結果。冬季可適當延長取材時間。另外，所有操作均需在冰上進行。采血時需要將采血管適當上下顛倒混勻，以避免采血過程中發生凝血或溶血。

3 結 語

在教學或研究慢性高原病的發病機理及其防治對策時，建立一個理想的實驗動物缺氧模型無疑具有極其重要的意義。理想的低壓缺氧動物模型可用于高原環境所致的心、腦、肺[9-11]等相關疾病機理及防治的研究。理想的實驗模型應具備重復性好、操作性強，特異性強等特點。細節往往是決定實驗模型復制成功的關鍵因素，注重細節，選擇模型復制的有利因素，規避模型復制的危害因素，可以很大程度上提高模型復制的成功率，也可使低壓缺氧大鼠模型的復制更加穩定，對實踐教學，甚至慢性高原病病因、發病機制等研究順利進行起到積極作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.055

B

1009-5519（2015）09-1410-03

2015-01-27）

國家973計劃項目（2012CB518201）；國家自然科學基金資助項目（81370150，30973446）；重慶市研究生教育教學改革研究項目（yjg143068）。

李曉栩（1985-），女，重慶榮昌人，實驗師，碩士研究生，主要從事高原病等基礎研究；E-mail：kangleshizhu@163.com。

官立彬（E-mail：libinguan84@163.com）。