肺抑瘤膏對血瘀體質(zhì)lewis荷瘤小鼠血流變學(xué)的干預(yù)作用

第一作者：鄭心(1964—),女，主任醫(yī)師。

★　鄭心*　孟憲志

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院　濟(jì)南 250001)

肺抑瘤膏對血瘀體質(zhì)lewis荷瘤小鼠血流變學(xué)的干預(yù)作用

*第一作者：鄭心(1964—),女，主任醫(yī)師。

★鄭心*孟憲志

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院濟(jì)南 250001)

摘要：目的：觀察肺抑瘤膏對血瘀體質(zhì)lewis荷瘤小鼠血流變學(xué)的干預(yù)作用。方法：首先進(jìn)行血瘀體質(zhì)模型的建立，繼而進(jìn)行l(wèi)ewis腫瘤細(xì)胞的接種，將體質(zhì)造模成功并且荷瘤成功的小鼠隨機(jī)分為血瘀對照組和血瘀給藥組，給藥組給予肺抑瘤膏灌胃，觀察兩組小鼠外周血Fib、D-dimer、全血黏度的差異性。結(jié)果：肺抑瘤膏可以有效改善血瘀體質(zhì)荷瘤小鼠的高凝、高黏狀態(tài)。結(jié)論：對腫瘤患者偏頗體質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，是中藥治療腫瘤的一種思路和方法。

關(guān)鍵詞：肺抑瘤膏；lewis；血瘀體質(zhì)；血流變學(xué)

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞株動物品系C57BL/6近交系小黑鼠，等級SPF級別，雄性，6～8周齡，體重(18±2)g，65只。質(zhì)量檢測單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所；出售單位：北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2009-0004)；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20℃～22℃，相對濕度范圍(50±5)%，通風(fēng)良好，小鼠維持飼料喂養(yǎng)，自由采食，飲水，根據(jù)墊料清潔干燥程度及時進(jìn)行更換墊料。

Lewis肺癌細(xì)胞株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供并予以接種，接種所用小鼠為全部小鼠隨機(jī)抽取5只。接種成功后送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，再隨機(jī)抽取10只作為傳代用小鼠。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑鹽酸腎上腺素注射液，規(guī)格1mL：1mg，購自上海禾豐制藥有限公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)器材德國Sartorius實(shí)驗(yàn)室專業(yè)天平自動血流變測試儀、生物顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺、高速臺式低溫離心機(jī)、制冰機(jī)等均由山東省疾病控制中心提供。

1.4主要實(shí)驗(yàn)藥物肺抑瘤膏處方：黨參24g，黃芪18g，炒白術(shù)12g，茯苓15g，麥冬20g，白花蛇舌草24g，半枝蓮24g，薏苡仁30g，浙貝母15g，貫眾15g，夏枯草18g，女貞子21g，山慈菇21g，莪術(shù)18g，蜂房15g，甘草6g，阿膠12g。

藥物由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供，10倍劑量加蜂蜜60g加工制成。

2實(shí)驗(yàn)分組、方法及評價標(biāo)準(zhǔn)

為保證實(shí)驗(yàn)連貫性，本次實(shí)驗(yàn)分為兩個部分同時進(jìn)行，即血瘀體質(zhì)造模與腫瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

2.1血瘀體質(zhì)造模階段分組、方法及評價標(biāo)準(zhǔn)

2.1.1分組方法在剩余的50只小鼠中隨機(jī)抽取10只作為體質(zhì)造模對照組，剩余40只作為體質(zhì)造模組。

2.1.2造模方法參考周氏[1]血瘀證小鼠動物模型建造方法，設(shè)計血瘀體質(zhì)造模方法。具體如下：每天9:00進(jìn)行小鼠頸背部皮下注射鹽酸腎上腺素，按照小鼠體重0.08mg/100g的劑量，并用生理鹽水調(diào)整液體體積為0.2mL，每天注射1次，連續(xù)注射1周。對照組注射相同劑量的生理鹽水，注射操作均由一人完成。

2.1.3評價標(biāo)準(zhǔn)由于小鼠取血后即死亡，為了保證下一步中藥干預(yù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，故只選用小鼠宏觀表征來進(jìn)行觀察，包括小鼠生活習(xí)性、飲食量、毛發(fā)情況、脈絡(luò)瘀血情況(口周、齒齦爪甲、耳緣、肛周紫黯)。

2.2肺抑瘤膏干預(yù)階段分組、方法及評價標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1Lewis肺癌模型建立方法將已經(jīng)購買的荷瘤小鼠于SPF級動物房常規(guī)飼養(yǎng)，等待14天，腫瘤得到充分生長，行頸椎脫臼法將小鼠全部處死，于超凈工作臺上進(jìn)行腫瘤的剝離操作，操作時培養(yǎng)皿下當(dāng)放置冰袋以控制溫度，使用鑷子和剪刀完整剝離瘤體，同樣放置在墊以冰袋的培養(yǎng)皿上面，用無菌生理鹽水進(jìn)行沖洗，將腫瘤組織周圍的壞死組織、脂肪、血管等與瘤體分離，良好的腫瘤組織當(dāng)為肉眼觀察的魚肉樣組織。將取出的腫瘤組織迅速放入200目過濾網(wǎng)中，加入少量無菌生理鹽水，用研磨棒充分研磨，取混懸液放入高速低溫離心機(jī)離心3次，取上清液。根據(jù)李氏[2]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及本課題預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×107/mL。并在電子光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，保證活細(xì)胞數(shù)量在95%以上方可。迅速將調(diào)整好濃度的細(xì)胞混懸液接種至荷瘤組的10只小鼠右側(cè)腋下，每只注射0.2mL,整個操作過程要求在1h之內(nèi)完成。接種成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：接種1周后可于小鼠右側(cè)腋下出現(xiàn)可觸摸到瘤結(jié)節(jié)，即為造模成功。

將10只接種成功的小鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，待14d后腫瘤充分生長之后，重復(fù)上述步驟操作，將調(diào)整好濃度的腫瘤細(xì)胞懸液，按照之前操作要求迅速接種于體質(zhì)造模完成的40只小鼠右側(cè)腋下，每只接種0.2mL,造模過程要求在1h之內(nèi)完成。在接種腫瘤1周后，將接種失敗的小鼠脫落處理，本次接種無脫落小鼠。

2.2.2分組及給藥方法將血瘀體質(zhì)造模成功并且荷瘤成功的40只小鼠隨機(jī)平均分為兩組。一組為血瘀對照組，一組為血瘀給藥組。血瘀給藥組每天兩次給予肺抑瘤膏灌胃，每次每只0.2mL肺抑瘤膏(相當(dāng)于生藥量40g/kg)，血瘀對照組每天兩次給予0.2mL生理鹽水灌服。

2.2.3觀察指標(biāo)小鼠纖維蛋白原(Fib)、D-2聚體(D-dimer)、全血黏度。兩組小鼠行眼眶取血，每組10只血樣送往山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院化驗(yàn)科進(jìn)行Fib、D-dimer檢測；剩余10只血樣用血流變自動檢測儀分別以10S-1、50S-1、200S-1三個切變率進(jìn)行全血黏度檢測。

3統(tǒng)計分析

本課題數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1造模階段小鼠宏觀表征觀察結(jié)果體質(zhì)造模1周后，相較于對照組小鼠，血瘀體質(zhì)造模組小鼠出現(xiàn)喜扎堆、活動量減少、偶有幾只出現(xiàn)蜷縮少動。通過每天食量觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠進(jìn)食量逐漸減少，形體相對對照組略顯消瘦，毛發(fā)出現(xiàn)不規(guī)整，毛色黯無光澤；通過觀察小鼠口周、齒印爪甲、耳緣以及肛周，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同程度的脈絡(luò)瘀血，少則1處，多則3處，認(rèn)為全部造模成功。

4.2中藥干預(yù)階段小鼠Fib、D-dimer、全血黏度觀察結(jié)果見表1

表1　小鼠Fib、D-dimer、全血黏度結(jié)果

注：上述兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢測，五個指標(biāo)均P<0.05。

5討論

血瘀體質(zhì)是諸多體質(zhì)中一種重要的體質(zhì)。血瘀體質(zhì)的存在常導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)血運(yùn)不暢，甚或瘀血內(nèi)阻的病理基礎(chǔ)，進(jìn)一步導(dǎo)致整個機(jī)體臟腑組織的血運(yùn)障礙。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有“素有惡血在內(nèi)”的表述。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血瘀體質(zhì)個體常存在明顯的血液流變學(xué)改變，表現(xiàn)出“濃、粘、凝、聚”的特點(diǎn)，同時也存在著血液高凝狀態(tài)及纖溶亢進(jìn)狀態(tài)。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，血瘀體質(zhì)的群體更容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；而腫瘤一旦產(chǎn)生，其存在又可以通過多種機(jī)制造成患者血液的高凝、高黏狀態(tài)。既往研究也發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與高凝狀態(tài)密切相關(guān)[3]。同時高凝、高黏狀態(tài)也是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的危險因素[4]。

目前，中醫(yī)藥治療腫瘤取得了很大的進(jìn)步，但是在理論研究方面還有待補(bǔ)充和完善。通過體質(zhì)的角度進(jìn)行中藥抗腫瘤的研究尚未大范圍展開。本次實(shí)驗(yàn)即選擇了血瘀體質(zhì)作為治療肺癌的切入點(diǎn)，選用了在臨床中療效顯著的肺抑瘤膏進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)通過模擬患者的血瘀體質(zhì)進(jìn)行血瘀體質(zhì)小鼠模型的構(gòu)建，再在其基礎(chǔ)上進(jìn)行l(wèi)ewis細(xì)胞的接種，構(gòu)建血瘀體質(zhì)肺癌的雙重模型，最后應(yīng)用肺抑瘤膏進(jìn)行干預(yù)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺抑瘤膏可以很好的改善小鼠模型的血流變指標(biāo)，改善了在體質(zhì)與腫瘤雙重作用下的外周血高凝、高黏狀態(tài)。由此可以得出一個結(jié)論：對腫瘤患者的偏頗體質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，是中藥治療腫瘤的一種思路和方法。

參考文獻(xiàn)

[1]周華妙,郭勇.寒凝血瘀證小鼠動物模型的建立及評價[J].中國中醫(yī)藥科技,2010,17(1):1-2,7.

[2]李春艷,王穎,劉浩,等.C_(57)BL/6近交系小鼠Lewis肺癌動物模型:建設(shè)性描述肺癌損害程度的指標(biāo)[J].中國臨床康復(fù),2003,7(26):3 582-3 583.

[3]耿振英,張俠.高凝狀態(tài)與惡性腫瘤[J].中國微循環(huán),2008,12(5):323-325.

[4]Elalamy I, Verdy E, Gerotziafas G, et al. Pathogenesis of venous throm- boembolic disease in cancer[J].Pathologie-biologie,2008,56(4):184-194.

收稿日期：(2014-12-16)編輯：萬崇毅

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A