人乳頭狀瘤病毒檢測方法研究進展

人乳頭狀瘤病毒檢測方法研究進展

張媛媛綜述古扎麗努爾·阿不力孜審校

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦外五科， 烏魯木齊830011)

摘要:人乳頭狀瘤病毒(Humanpapilloma virus， HPV)的持續感染是宮頸癌發生和發展的重要條件。HPV的檢測對宮頸癌及癌前病變的早期診斷、治療后隨訪具有重要意義。本文就HPV檢測方法研究進展作一綜述。

關鍵詞:宮頸癌； 人乳頭瘤病毒； 檢測方法； 雜交捕獲二代； 實時聚合酶鏈反應； Cervista HPV HR 檢測法

中圖分類號：R446.5文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.006

[收稿日期：2014-11-23]

基金項目：國家自然科學基金(81460752)

作者簡介：屈亞琴(1988-)，女(回族)，在讀碩士，研究方向：維中西醫結合研究卵巢早衰。

宮頸癌是對女性健康造成嚴重危害的惡性腫瘤,其發病率位于全球女性惡性腫瘤第二位,全世界每年的新發病例約為50萬人,死亡人數約27萬，發展中國家占統計數據中的80%[1]。很多文獻報道， 在宮頸上皮內瘤變( CIN) I中人乳頭狀瘤病毒(humanpapilloma virus， HPV)的感染率為70%～78%， 在CINⅡ～ Ⅲ中為80%～89% ，在宮頸癌中則超過95%[ 2]。目前被公認的宮頸病變主要危險因素為持續感染高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)，宮頸癌明確的致病因素和緩慢的發病過程為普查普治提供了寶貴時機[3-5]。 HR-HPV的檢測成為防治宮頸癌的一個重要環節，很多發達國家已經將HPV DNA 檢測列為宮頸癌篩查的必檢項目[ 6]。HPV DNA檢測方法可分為定量檢測和定性檢測2種。目前，2種HPV檢測法根據臨床需要用于宮頸癌的篩查、隨診、預后評估。本文就 HPV檢測方法的研究進展相關內容進行綜述。

1細胞學檢測及血清學檢測

細胞學檢測簡單易行，但靈敏度不高，主要由于巴氏涂片的取材、制片及閱片者的主觀因素影響。免疫組化法主要檢測的是 HPV 抗原，其原理是通過抗 L1蛋白抗體與對應的 HPV 外殼蛋白反應來檢測 HPV。雖然免疫組織化學法對于診斷 HPV 感染有很強的說服力，操作簡單，能準確定位，但是仍存在假陰性較高及靈敏度較低等缺點，且不便于對 HPV進行分型， 因而目前應用較少。

2聚合酶鏈反應(PCR)

2.1實時熒光定量核酸擴增檢測法(FQ -PCR )PCR可擴增靶序列至少100萬倍,為HPV檢測最敏感的技術。FQ- PCR 是 1995 年由美國 Perkin Flmer 公司研制成功的一種新型核酸定量檢測方法。實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。由于熒光探針的引入, 而且被釋放的熒光基團數目與 PCR 產物數量相同, 常用的 PCR 擴增儀與傳統 PCR 擴增儀相比, 具有應用更廣泛、定量測量、檢測效率明顯提高、擴增產物無需電泳分析、無管道內污染及結果重復性好等特點，因此該方法對 DNA 模板定量的準確性與特異性都有很大提高。 相對于傳統電泳法，FQ -PCR檢測可以一次同時檢測多種 HPV 亞型的 DNA。在國內，常見的高危 HPV 亞型為 HPV16、 18、 31、 33、35、45 、52、 53、 56、 58亞型，高危型HPV感染需要引起高度重視，嚴密隨訪或進一步處理。由于該方法取材后易保存，無需另外添置雜交儀和基因芯片閱讀儀，因此對于大規模的宮頸癌篩查是適用的。

2.2巢式PCR巢式PCR也是一種聚合酶鏈反應(PCR)，但其為變異的PCR，較傳統的PCR反應只是用1對PCR引物(與巢式PCR的第1對PCR引物擴增片段相似)，巢式PCR使用2對引物。第2對引物又叫巢式引物，第2次PCR擴增片段短于第1次擴增，這是由于PCR擴增片段在第1次PCR擴增片段的內部，結合在第1次PCR產物內部。因此巢式PCR的擴增特異性很強。如果第1次擴增產生了錯誤片斷，第2次擴增的概率很低。它的優點還有克服了單次擴增的“平臺期效應”，擴增倍數的提高大大增加了PCR的靈敏度；第1次擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第2次擴增。從而提高反應的特異性，保證整個反應的準確性及可行性。

3雜交俘獲試驗

3.1基因捕獲DNA檢測法(hybridca Pture DNA test，HC2)HC2是最早通過美國FDA批準可在臨床使用的HPV DNA檢測方法， 在國內發達地區也被廣泛用于臨床HPV的檢測及宮頸癌及宮頸癌前病變的篩查[7-8]。HC2本質上是利用分子雜交化學發光使信號放大的原理，屬于線性級數放大 。

該方法采用半自動檢測方式，利用 RNA 探針與對應基因進行雜交,形成 RNA-DNA混合物被標記有特異性單克隆抗體的微孔板捕獲,通過加入底物進行化學發光比色,光的強弱對應于標記物堿性磷酸酶含量的高低,從而確定待測的 HPV DNA的含量[9]。德國一項納入8 466 例患者的研究發現， HC2檢測 CIN Ⅱ級的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為97.8%、95.3%、10.9%和 100%，而常規細胞學檢測 CIN Ⅱ級的靈敏度僅為43.5%[10]。但其有局限性，可能存在病毒感染水平很低或者采樣不正確導致的假陰性；易產生交叉污染，實驗中還存在高危型探針可與低危型探針發生交叉反應、成本較高、操作復雜、耗時長等不足[11]。

3.2Cervista HPV HR 檢測法Cervista HPV HR 是一種由美國FDA 批準的、定性的體外診斷檢測方法，其采用Invader(Hologic 公司)—— 一種用于檢測特定核苷酸序列的信號放大方法來檢測DNA 的14種高危型HPV 病毒。2009 年3 月，Cervista(豪洛捷，貝德福德，MA)高危型HPV DNA 檢測及Cervista HPV 16/18 型檢測獲得了美國FDA 的認證，Cervista HR HPV DNA 檢測及Cervista HPV16/18 分型檢測僅可用于采用特定器械及反應試劑收集的宮頸細胞學標本。Cervista HR HPV DNA 檢測不僅可以檢測與HC2 檢測相同的13 種高危型HPV，還可以檢測2009 年國際癌癥研究署最新確認的HPV66 型。HPV66型在全球的感染率約為0.4%，不同地區之間存在差異，在HPV66 型陽性人群中CIN2的檢出率為0.5%[12]。Cervista檢測技術將高危型HPV 分為3個組，分別為A5/A6 組(包括HPV51、56、66 亞型)、A7 組(包括HPV18、39、45、59、68亞型)和A9 組(包括HPV16、31、33、35、52、58亞型)。Kjar等[13]研究發現感染A9 組HPV 的陽性率為22.7%，而感染A5/A6 組和A7 組HPV 的陽性率分別為2.9%和1.5%。CIN病變中最常見的HPV 亞型為16、58、31/33和35/36型，因此感染A9組HPV 的女性患CIN 病變的風險更高。

Cervista HPV HR 檢測法采用唯一通過FDA 認證的擁有內部質控技術的產品可避免因樣本量不足引起的假陰性，并且可以確認是否存在反應抑制物，從而確保陰性結果的準確性，不與低危型HPV 發生交叉反應，減少假陽性結果。同時檢測HPV 的L1、E6/7 區，避免其他方法僅檢測L1 區造成的假陰性，其特異性明顯提高。Kham等[14]比較了50 000例樣本的Cervista 及HC2檢測結果，發現HC2 無內部質控機制，而Cervista 檢測(內部質控)有1.1%的樣本提示樣本量不足，因此由于Cervista 檢測技術存在內部質控機制，可以避免因樣本量不足引起的假陰性。

Cervista 檢測技術的另一優點是所需的細胞保存液量僅為HC2 的一半。Wright 等[15]對1 347例有細胞學、高危型HPV檢測、陰道鏡及組織病理活檢資料的女性進行Cervista HR HPV DNA 檢測及Cervista HPV 16/18 型檢測。研究發現在細胞學AS-CUS女性中，高危型HPV 對CINⅡ及以上的敏感性為92.8%，陰性預測值為99.1%；對CINⅢ及宮頸癌的敏感性和陰性預測值均為100%；對CINⅡ及以上和CINⅢ或宮頸癌的特異性分別為44.2%及43%。結果表明，對細胞學AS-CUS 的女性，Cervista HR-HPV DNA 檢測可以聯合細胞學檢查用于宮頸癌的篩查。

4基因芯片技術

基因芯片(genechip)也稱為DNA芯片，Digene 公司在雜交捕獲法的基礎上結合基因芯片推出了HC Express Array 技術。其原理是采用原位合成或顯微點樣技術將許多的DNA探針固化于支持物表面上,產生二維DNA探針陣列,然后與標記的樣品進行雜交,通過檢測雜交信號來實現快速、并行、高效的檢測。由于該技術具有快速分型和定量的特點，因此可為臨床提供更多的診斷依據和參考價值.

基因芯片法克服了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、自動化程度低、通量低的缺點，可對大量標本進行一次性HPV檢測，并提高了靈敏度和特異度，與熒光定量 PCR相比陽性率高出 6.45%[16]。隨著基因芯片技術的發展，目前可檢測 20 多種基因分型的芯片[17]。相對于雜交捕獲法，基因芯片技術不但能對HPV進行分型檢測，還可同時監測多個型別的混合感染，并對 HPV 疫苗的研制提供科學依據。但其也有一定的局限性，操作相對復雜，價格昂貴，因此對于大規模的宮頸癌篩查很難實現。在操作過程中也需要嚴格的質量控制，盡量降低由于PCR產物污染造成的假陽性。

綜上所述，目前已證實高危型HPV感染是宮頸癌的主要致病病因，由于其發病原因明確，通過阻斷HPV的持續感染可以阻斷子宮頸癌的發生。因此HPV的檢測在宮頸癌的篩查、宮頸癌前病變及宮頸癌治療后的隨訪有重要的意義。目前HPV檢測的方法很多,但因為功能定位不同,如用于篩查、療效評估或隨訪、科研等不同目的,所采用的方法或順序也有所區別。每種HPV檢測方法都有其優缺點，相信通過不斷的努力，將來會產生出簡便、低廉、準確的HPV檢測方法，造福于廣大婦女同胞。

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(本文編輯王艷)

通信作者：夏米西努爾·伊力克，女(塔塔爾族)，教授，碩士生導師，博士，研究方向：維中西醫結合研究卵巢早衰，E-mail:shamshinur@aliyun.com。

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