TNF-α-308位點基因多態性與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的相關性分析

朱琳琳，麥靜愔(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海200021)

TNF-α-308位點基因多態性與阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的相關性分析

朱琳琳，麥靜愔
(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海200021)

摘要:目的探討TNF-α-308位點基因多態性與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)的相關性。方法采用PCR產物直接測序法，對上海地區200例OSAHA患者(OSAHA組)和200例健康體檢者(對照組)進行TNF-α-308位點基因多態性檢測。結果TNF-α-308位點存在GG、GA和AA三種基因型。OSAHA組與對照組GA基因型頻率分別為23.0%和15.5%，AA基因型頻率分別為15.0%和1.5%，A等位基因頻率分別為25.6%和9.6%，OSAHA組均明顯高于對照組(P＜0.05或＜0.01)。多因素Logistic回歸分析顯示，GA基因型(OR =1.13，95%CI: 1.11～1.16)、AA基因型(OR =1.23，95%CI: 1.17～1.29)、A等位基因(OR =1.06，95%CI: 1.05～1.07)為OSAHS的易感因素，P均＜0.01。結論OSAHA的發病與TNF-α-308位點基因多態性存在相關性，攜帶AA基因型者發病風險較高。

關鍵詞:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征;多態性; TNF-α基因

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是一種常見的睡眠障礙性疾病，具有家族聚集性和遺傳性［1］;近年來遺傳因素在OSAHS中的重要性日益受到重視，但結論不一［2，3］。關于OSAHS與易感因素相關性的研究逐漸成為研究的熱點。本研究選取上海地區200例OSAHS患者為研究對象，對TNF-α-308位點進行基因多態性檢測，探討其與OSAHS的相關性。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012～2014年在上海中醫藥大學附屬曙光醫院呼吸科及睡眠呼吸監測中心就診的OSAHS患者200例(OSAHS組)，其中男162例、女38例，年齡(49.2±8.7)歲。OSAHS患者均接受多導睡眠呼吸檢測，均符合《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》的診斷標準［1］。排除慢性呼吸系統疾病、自身免疫性疾病及其他感染性疾病。選擇同期健康體檢者200例作為對照組，其中男154例、女46例，年齡(47.7±6.8)歲。兩組性別、年齡具有可比性。所有入選者均系近三代為上海地區、彼此間無血緣關系的原住居民，且簽署書面的志愿書。本研究由上海中醫藥大學附屬曙光醫院的倫理委員會批準。

1.2多導睡眠呼吸監測所有受試者在上海中醫藥大學附屬曙光醫院睡眠監測中心接受多導睡眠呼吸監測(晚20: 00至次日晨8: 00)，采用澳大利亞生產的E型多導睡眠呼吸監測系統進行監測。

1.3 TNF-α-308位點基因多態性檢測采用PCR產物直接測序法。采集兩組清晨空腹靜脈血5mL，注入含有EDTA的抗凝管中，搖勻，對樣本編號并登記，留取全血置于－80℃冷凍保存。標本按照試劑盒說明，使用離心柱型柱式血液基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取，－20℃保存備用。參照Sakao等［4］設計的引物，正向引物為5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'，反向引物為5'-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3'。引物由北京鼎國生物工程公司合成。PCR反應體系為35 μL: 10mmol/LdNTP混合物2 μL，10×Taq Buffer 3.5 μL，2U TaqdNA聚合酶，10 μmol/L上下游引物各1 μL，超純水補足至35 μL。所用試劑均購置于北京鼎國生物工程公司。PCR擴增條件: 95℃預變性5min; 95℃變性30 s，63℃退火40 s以及72℃延伸60 s共35個循環;然后72℃延伸10min，最后4℃保存。將PCR擴增產物5mL加入預先加有溴化乙錠核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓120 V，20min)，在自動成像分析儀上成像。PCR產物由北京鼎國公司進行純化測序。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。直接計數法計算等位基因及基因型頻率，各組間基因型

和等位基因頻率的比較及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗［5］采用χ2檢驗;計量資料以珋x±s表示，多因素調整采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 TNF-α-308位點基因多態性測序結果TNF-α-308位點存在GG、GA和AA三種基因型，見插頁Ⅱ圖6。統計實驗個體中三種基因型的數目，經χ2檢驗后基因型符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，說明本研究采用的研究對象具有群體代表性。

2.2 TNF-α-308位點基因型及等位基因頻率兩組TNF-α-308位點基因型及等位基因頻率比較差異均具有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。見表1。

表1　兩組TNF-α-308位點基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

2.3TNF-α基因-308位點基因型及等位基因與OSAHS易感性的關系經多因素Logistic回歸分析，GA基因型(OR = 1.13，95% CI: 1.11～1.16)、AA基因型(OR = 1.23，95% CI: 1.17～1.29)、A等位基因(OR =1.06，95% CI: 1.05～1.07)為OSAHS的易感因素(P均＜0.01)。

3　討論

人類TNF-α基因位于染色體6p21.1-p21.3區域。研究表明，TNF-α基因多態性主要存在其啟動子上游，包括－1196C/T、－1031T/C、－863C/A、－857C/T、－572A/C、－376G/A、－316G/A、－308G/A、－238G/A、－204T/C和+ 489G/A［6］。Louis等［7］發現，TNF-α-308 G/A突變雜合子的TNF-α產量顯著性高于GG野生型，說明在機體發生相同的病理刺激后，TNF-α-308突變影響TNF-α基因的表達量，進而影響OSAHS的發生、發展。

本研究對TNF-α-308位點基因測序發現，OSAHS組GA和AA基因型頻率及A等位基因頻率均明顯高于對照組。經多因素Logistic回歸分析，GA基因型、AA基因型、A等位基因為患OSAHS的易感因素，且攜帶GA基因型和攜帶AA基因型者患OSAHS的風險增加(1.13倍和1.23倍)，明顯大于攜帶GG基因型者。本研究結果與劉輝國等［8］、Wilson等［9］、關鍵等［10］、Riha等［11］的研究結果一致: A等位基因與OSASH的發病有相關性。

總之，TNF-α基因可能是OSAHS的一個遺傳候選基因，啟動子上游第308位點基因多態性增加了對OSAHS的易感性。OSAHS是復雜的多基因遺傳病，不同種族人群之間的易感性可能存在一定的差異，在今后的研究中應繼續擴大樣本量，研究不同人群中TNF-α基因與OSAHS組易感性的相關性，同時對與OSAHS易感性相關的其他基因進行研究為最終揭示OSAHS發生、發展的分子機制提供更多的科學依據。

參考文獻:

［1］中華醫學會呼吸病學會睡眠呼吸疾病學組.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南［J］.中華結核和呼吸雜志，2012，35(1): 9-12.

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［3］Riha RL，Brander P，Venellem，et al.Tumor necrosis factor-alpha(-308)gene polymorphism in obstructive sleep apnoea-hypopnoea syndrome［J］.Eur Respir J，2005，26(4): 673-678.

［4］Sakao S，Tatusumi K，Igari H et al.Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter poIymorphism with the presence of chronic obstructive pulmonarydisease［J］.Am J Respir Crit Caremed，2001，163(2): 420-422.

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［6］GingomR，Silveira LJ，Miller YE，et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms are associated with COPD［J］.Eur Respir J，2008，31(5): 1005-1012.

［7］Louis E，Franchimontd，Piron A，et al.Tumor necrosis factor(TNF)gene polymorphism influences TNF-alpha production in lipoplysaccharide(LPS)-stimulated whole blood cell culture in healthy humans［J］.Clin Exp Immunol，1988，113(3): 401-406.

［8］劉輝國，管頻，林枚，等.腫瘤壞死因子基因多態性呼吸暫停低通氣綜合征［J］.中華結核與呼吸雜志，2006，29(9): 596-599.

［9］Wilson AG，Symons JA，McDowell TL，et al.Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcript activation［J］.Proc Ned Acad Sci U S A，1997，94(7): 3195-3199.

［10］關建，易紅良，孟麗麗，等.腫瘤壞死因子-a基因多態性與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征及代謝綜合征共病性研究［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2013，20(1): 1-11.

［11］Riha RL，Brander P，vennellem，et al.Tumour necrosis factor-alpha(-308)gene polymorphism in obstructive sleep apnoea-hypopnoea syndrome［J］.Eur Respir J，2005，26(4): 673-678.

收稿日期:( 2014-08-08)

通信作者:麥靜愔，E-mail:maijingyin@126.com

文章編號:1002-266X(2015)36-0053-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R767.13

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.020