人喉鱗癌Hep-2細胞血紅素加氧酶1表達及其對卡鉑作用的影響

呂欣，宋冬梅，王寶山，2(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，石家莊05003;2河北醫(yī)科大學)

人喉鱗癌Hep-2細胞血紅素加氧酶1表達及其對卡鉑作用的影響

呂欣1，宋冬梅1，王寶山1，2
(1河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，石家莊050031;2河北醫(yī)科大學)

摘要:目的探討人喉鱗癌Hep-2細胞血紅素加氧酶1(HO-1)表達對卡鉑作用的影響及其可能的作用機制。方法將對數生長期Hep-2細胞分為六組。空白對照組不干預，ZnPP(HO-1抑制劑鋅原卟啉)組加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin(HO-1誘導劑氯化血紅素)組加入Hemin 10 μmol/L;卡鉑組加入卡鉑10 μg/mL; Hemin聯合卡鉑組先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL; ZnPP聯合卡鉑組先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL。每組設5個復孔，加藥后培養(yǎng)24 h。采用MTT法觀察各組細胞存活率; RT-PCR、Western blotting法檢測各組細胞內HO-1mRNA和蛋白表達情況;dCFH-DA探針檢測各組細胞內活性氧(ROS);流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。結果①細胞存活率:與空白對照組比較，卡鉑組和ZnPP組明顯降低，Hemin組明顯升高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組明顯降低，Hemin聯合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。②細胞HO-1mRNA和蛋白相對表達量:與空白對照組比較，卡鉑組和Hemin組明顯升高，ZnPP組明顯下降(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組明顯降低，Hemin聯合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。③細胞凋亡率:與空白對照組比較，卡鉑組、ZnPP組明顯升高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組明顯升高，Hemin聯合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05);④細胞內ROS活性:與空白對照組比較，卡鉑組、ZnPP組顯著增高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組明顯升高，Hemin聯合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05)。結論HO-1在Hep-2細胞內的高表達可影響卡鉑對Hep-2細胞的促凋亡作用，應用ZnPP后HO-1表達下調，同時提高了人喉鱗癌Hep-2細胞在卡鉑作用下的凋亡率，這一過程可能與增強細胞內ROS水平相關。

關鍵詞:喉鱗癌;血紅素加氧酶1; Hep-2細胞;卡鉑;細胞凋亡

HO-1 expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells and its influence on Carboplatin’s effects

LYU Xin1，SONGdong-mei，WANG Bao-shan
(1 The First Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050031，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of heme oxygenase-1(HO-1)expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells on the Carboplatin’s effects and its possiblemechanism.Methods Hep-2 cells in the logarithmic phase weredivided into six groups.The blank control group was not treated，ZnPP group was treated with 10 μmol/L HO-1 inhibitor，Hemin group was treated with 10 μmol/L HO-1 inducer，and Carboplatin group was treated with 10 μg/mL，Hemin combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L Hemin alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin，ZnPP combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L ZnPP alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin.These six groups all had five complex holes and were cultured for 24 h afterdosing.The survival rates were evaluated bymTT assay.The expression of HO-1mRNA and protein wasdetected by RT-PCR and Western blotting.Intracellular ROS activity was examined bydCFH-DA probe.The apoptosis rate was performed by flow cytometry.Results①the cell survival rate: compared with the control group，the survival rates of Hep-2 cells in the ZnPP and Carboplatin groups were significantlydecreased，but the survival rate in the Hemin group was increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the survival rate of the Znpp combined with Carboplatin group wasdecreased and the He-

min combined with Carboplatin group was increased(all P＜0.05).②HO-1 inmRNA and protein levels: compared with the control group，the expression of HO-1mRNA and protein was increased in the Hemin and Carboplatin groups and wasdecreased in the ZnPP group(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the Znpp combined with Carboplatindecreased，but HO-1 expression was increased in the Hemin combined with Carboplatin group(all P＜0.05).③the apoptosis rate: compared with the control group，the apoptosis rates in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P ＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the apoptosis rate，but Hemin combined with Carboplatindecreased the apoptosis rate(all P＜0.05).④the ROS activity: compared with the control group，the the ROS activities in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the ROS activity，but Hemin combined with Carboplatindecreased the ROS activity(all P＜0.05).Conclusions HO-1 overexpressionmay affect the pro-apoptotic effects of Carboplatin on Hep-2 cells，and the application of ZnPPdown-regulates the HO-1 expression and increases the apoptosis rate of Hep-2 cells with treatment of Carboplatin.In this process，the elevation of intracellular ROS activitymay be involved.

Key words:laryngeal squamous-cell carcinoma; heme oxygenase-1; Hep-2 cells; Carboplatin; apoptosis

血紅素氧合酶1(HO-1)屬于微粒體催化酶類，是降解血紅素重要的限速酶之一，其可將血紅素分解為一氧化碳、Fe2 +、膽綠素等［1～3］。HO-1是一種細胞保護性酶，具有抗炎、抗氧化及抑制細胞凋亡等重要生物學作用;但近年來研究發(fā)現，HO-1的這一細胞保護作用及抗凋亡特性可能是促進腫瘤細胞生長、轉移及產生治療抵抗的重要因素［4～6］，但具體機制不清。目前，HO-1在頭頸部腫瘤尤其是喉鱗癌中的作用鮮見報道。2014年11月～2015年5月，我們觀察了HO-1誘導劑氯化高鐵血紅素(Hemin)和HO-1抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)對人喉鱗癌Hep-2細胞內HO-1表達的影響及HO-1表達對卡鉑作用的影響，分析HO-1與喉鱗癌化療抵抗的關系，為喉鱗癌的治療尋找新的靶點。

1　材料與方法

1.1材料人喉鱗癌Hep-2細胞株(以下稱Hep-2細胞)本實驗室凍存。DMEM/F12購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司; Hemin購自美國Sigma公司(Lot NO.51280); ZnPP購自美國Santa Cruz Biotechnology公司(SC-200329);卡鉑購自山東齊魯制藥有限公司(國藥準字號H10920028);二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司(Lot NO.D-5879);四甲基噻唑基四唑(MTT)購自美國Sigma公司(Lot NO.M2128);碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司(Lot NO.P4170); HO-1及內參GAPDH引物由上海生工合成;兔抗人HO-1單克隆抗體購自美國abcam公司(ab13243);內參β-actin購自北京博奧森試劑公司(bs-0061R);活性氧檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所(S0033); RT-PCR檢測試劑盒購自立陶宛Fermentas公司(K1611，K1081)。

1.2細胞培養(yǎng)、分組及干預將Hep-2細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2的孵箱內培養(yǎng)。以0.25%胰酶消化傳代，2～3d傳代1次，實驗細胞均處于對數生長期。將Hep-2細胞胰酶消化后，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，待細胞貼壁12 h后分為六組。空白對照組不干預，ZnPP組加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin組加入Hemin 10 μmol/L;卡鉑組加入卡鉑10 μg/mL; Hemin聯合卡鉑組先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL; ZnPP聯合卡鉑組先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL。每組設5個復孔，加藥后均培養(yǎng)24 h。

1.3 Hep-2細胞存活率檢測采用MTT法。每孔加入5mg/mLmTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，徹底去上清后加DMSO 200 μL/孔，振蕩30min至結晶完全溶解，酶標儀測定570 nm處的光密度值(OD 值)，實驗重復5次。細胞存活率(%)=(OD試驗孔/OD對照孔)×100%。

1.4 Hep-2細胞HO-1mRNA及HO-1蛋白表達檢測采用RT-PCR法檢測各組Hep-2細胞HO-1mRNA表達:各組加藥培養(yǎng)24 h后TRIzol法提取總RNA，取等量RNA(500 ng)逆轉錄為cDNA。HO-1上游引物5'-CTTTGGTCAATGACACCGTG-3'，下游引物5'-TGTTTGTGGTAAGCCATCCA-3'，產物長度168 bp;β-actin上游引物5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'，產物長度540 bp。基因擴增反應條件: 95℃預變性5min; 95℃、30 s，57℃、30 s，72℃、30 s，β-actin 26個循環(huán)，HO-1 29個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃、2 h。產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用Lab Work5.0系統(tǒng)進行圖像分析。采用Western blotting法檢測HO-1蛋白表達:各組加藥24 h后收集細胞，加入4℃預冷的RIPA細胞裂解液300

μL冰上裂解30min，期間細胞刮刀刮3次，4℃、12 000 r/min離心20min，取上清液5 μL，BCA法蛋白定量，取總蛋白量一致后進行SDS-PAGE電泳，電轉至PVDF膜上，然后置于5%脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，加入1∶2 000兔抗人HO-1一抗，同時用兔抗人β-actin(1∶500)作為內參，4℃過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，TBST溶液洗滌15min/2次，ECL發(fā)光顯色，結果掃描，HO-1蛋白條帶灰度值測定。

1.5Hep-2細胞內活性氧(ROS)檢測采用DCFH-DA探針檢測。加藥培養(yǎng)24 h后，胰酶消化、終止、收集細胞，收集細胞后裝載探針，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFHDA中，細胞密度為1×106/mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20min，無血清培養(yǎng)基洗3次，488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測各組熒光強度，結果以平均熒光強度表示細胞內ROS的相對活性。

1.6 Hep-2細胞凋亡率觀察加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化正常培養(yǎng)基終止消化后收集細胞，4℃預冷PBS洗滌細胞，1 500 r/min離心5min，重復2次，90%酒精固定－20℃保存12 h后，4℃預冷PBS洗滌細胞，1 500 r/min離心5min，重復2次，洗去酒精，制成單細胞懸液300 μL后加入PI使終濃度為10 μg/mL，室溫避光孵育20min，流式細胞儀計算細胞凋亡率。數據由ModFit2.0軟件系統(tǒng)分析。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，均數比較采用t檢驗，多組數據采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞存活率細胞存活率空白對照組為96.8%±1.09%，卡鉑組為75.3%±0.21%，ZnPP組為84.7%±0.04%，Hemin組為101.1%± 0.13%，ZnPP聯合卡鉑組為54.9%±0.31%，Hemin聯合卡鉑組為81.1%±0.19%; ZnPP組及卡鉑組明顯低于空白對照組; Hemin組明顯高于空白對照組; ZnPP聯合卡鉑組明顯低于卡鉑組，Hemin聯合卡鉑組明顯高于卡鉑組; P均＜0.05

2.2HO-1mRNA及HO-1mRNA蛋白表達與空白對照組比較，卡鉑組和Hemin組HO-1mRNA和HO-1蛋白明顯升高，ZnPP組明顯下降(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組HO-1mRNA和HO-1蛋白明顯降低，Hemin聯合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1　各組HO-1mRNA及蛋白相對表達(相對表達量，)

表1　各組HO-1mRNA及蛋白相對表達(相對表達量，)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與卡鉑組比較，#P＜0.05。

組別　HO-1mRNA　HO-1蛋白空白對照組11 ZnPP組　0.25±0.03*　0.57±0.07*Hemin組　1.82±0.11*　1.47±0.01*卡鉑組　1.22±0.03*　1.23±0.10*ZnPP聯合卡鉑組　0.47±0.00#　0.94±0.02#Hemin聯合卡鉑組　1.86±0.03* #　2.35±0.12*#

圖1　各組HO-圖1mRNA表達

圖2　各組HO-圖1蛋白表達

2.3ROS相對活性空白對照組、ZnPP組、Hemin組、卡鉑組、ZnPP聯合卡鉑組、Hemin聯合卡鉑組平均熒光強度分別為1、1.79±0.12、0.59±0.09、2.30 ±0.11、3.91±0.04、1.21±0.02;與空白對照組比較，卡鉑組、ZnPP組ROS活性顯著增高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯合卡鉑組ROS活性明顯升高，Hemin聯合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05)。

2.4細胞凋亡率空白對照組、ZnPP組、Hemin組、卡鉑組、ZnPP聯合卡鉑組、Hemin聯合卡鉑組細胞凋亡率分別為5.15%±1.27%、11.62%±1.02%、5.01%±0.94%、20.16%±1.02%、50.67%± 2.31%、13.62%±1.29%; Hemin組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);卡鉑組、ZnPP組明顯高于空白對照組(P均＜0.05); ZnPP聯合卡鉑組明顯高于卡鉑組，Hemin聯合卡鉑組明顯低于卡鉑組(P均＜0.05)。

3　討論

喉鱗癌早期癥狀隱匿、生長速度快，且對放化療的敏感度低。HO-1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及化療抵抗之間的關系目前雖不甚清楚，但近年來正逐漸引起臨床重視［7，8］。研究表明，HO-1在一部分腫瘤組織中呈強陽性表達，增加或降低HO-1的表達可影響腫瘤細胞的增殖與凋亡，目前在腫瘤治療過程中合理調控HO-1的表達正逐漸成為研究的一大熱點［9，10］。

Tan等［11］研究證實，在乳腺癌細胞中HO-1的高表達可促進乳腺癌細胞的增殖，促進其侵襲及轉

移，其潛在機制可能與HO-1促進細胞核增殖抗原及細胞周期調控蛋白Cyclin B1等表達有關。本研究結果表明，Hemin作用于Hep-2細胞后，細胞內HO-1mRNA和蛋白水平表達上調，而應用ZnPP后細胞內HO-1mRNA和蛋白水平表達下調，細胞活性降低。提示降低HO-1表達能夠抑制Hep-2細胞的生長活性。單獨應用化療藥物卡鉑后，細胞內HO-1表達增高，這一結果與卡鉑可促進細胞內ROS活性增強有關，ROS反應水平的增高可激活下游氧化應激反應原件ARE，進而激活Nrf2誘導HO-1表達，進而減弱卡鉑對于Hep-2細胞的殺傷作用。而聯合應用ZnPP抑制細胞內HO-1表達后，細胞存活率下降、凋亡率顯著增加。由此提示Hemin可誘導HO-1表達，對人喉鱗癌Hep-2細胞抵抗氧化應激損傷及化療藥物的殺傷存在部分保護作用，而聯合應用ZnPP阻斷細胞內HO-1表達后，能夠增強卡鉑對Hep-2細胞的殺傷作用。該機制與HO-1在白血病、肺癌、胰腺癌等實體腫瘤細胞中的報道一致［12～17］。

目前研究證實，腫瘤細胞在放化療過程中產生的自我保護及抵抗可能與HO-1的抗氧化應激反應有關。在腫瘤細胞中抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等均表現為下調趨勢;此時，HO-1及其代謝產物成為主要的抗氧化應激反應體系［18～20］。本實驗結果顯示，ZnPP下調人喉鱗癌Hep-2細胞內HO-1表達后，細胞存活率降低、凋亡率升高，細胞內ROS活性增加;聯合應用卡鉑化療后細胞凋亡率顯著升高，細胞內ROS活性進一步增加。而當卡鉑聯合應用Hemin后，細胞內ROS活性及細胞凋亡率下降，由此表明HO-1可能通過調節(jié)ROS活性影響卡鉑對Hep-2細胞的殺傷作用。同時也有研究報道，HO-1還可通過調節(jié)Akt途徑和P21蛋白等方式影響腫瘤細胞生物學行為，但具體機制不詳，還有待于進一步研究證實。

綜上所述，體外抑制HO-1表達能夠降低Hep-2細胞活性，增強卡鉑對Hep-2細胞的殺傷作用，其具體機制可能與增強細胞內ROS活性誘導細胞凋亡有關。HO-1可能在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展及治療過程中發(fā)揮重要作用，合理調控腫瘤細胞中HO-1表達有望成為喉鱗癌臨床治療的新突破。

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收稿日期:( 2015-06-30)

通信作者簡介:王寶山(1963-)，男，教授，博士研究生導師，研究方向為耳鼻咽喉頭頸外科學。E-mail: wbsent@126.com

作者簡介:第一呂欣(1983-)，男，助理研究員，研究方向為耳鼻咽喉頭頸外科學。E-mail: lvxin1983doctor@163.com

基金項目:河北省自然科學基金資助項目(H2013206264)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0007-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R739.65

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.003