PPARγ及其輔激活子MED1重組腺病毒的制備與生物學功能分析

白 亮，李倩薇，趙四海，賈玉枝，REDDY Janardan K，劉恩岐

（1．西安交通大學醫學部心血管中心動脈粥樣硬化與脂代謝研究室，陜西西安 710061；2．Department of Pathology，Feinberg School of Medicine，Northwestern University，Chicago，IL 60611，USA；3．西安交通大學醫學部醫學實驗動物中心，陜西西安 710061；4．陜西中醫學院，陜西咸陽 712046）

轉錄因子PPARγ是脂肪代謝的重要調控子，一直是科學研究者們關注的焦點［1-2］。在脂肪組織中，PPARγ表達最為豐富，調控脂肪細胞分化和能量儲存［3-4］。研究發現，MED1（mediator 1）是 PPARγ的關鍵輔激活子［5］。MED1能與許多核受體如PPARs、RARα、RXR和GR等，以及多種轉錄因子如p53、GATA 家族、PGC-1和C／EBPβ等結合，提示MED1在機體組織以及細胞代謝中具有重要調控作用［5-7］。

重組腺病毒是一類復制缺陷的腺病毒載體，具有轉染效率高、感染細胞范圍廣、病毒滴度高、可感染細胞周期中靜止期和分裂期細胞，同時可高效介導基因的體內外轉移等優點［8-9］。近年來，構建攜帶外源基因的重組腺病毒載體越來越多地用于基因功能的研究，還用于遺傳病和腫瘤的疾病基因治療［10］。本研究應用HEK293a細胞包裝擴繁Ad／PPARγ、Ad／MED1和對照Ad／LacZ，經CsCl梯度離心純化，大批量生產了細胞感染及活體注射所需的重組腺病毒，檢測了Ad／PPARγ和Ad／MED1的生物學特性，為今后深入研究PPARγ及其輔激活子MED1的基因功能以及二者之間的網絡調控關系提供了有利工具。

1 材料與方法

1．1 細胞及腺病毒載體 HEK293a和3T3-L1細胞系均購自美國ATCC細胞庫。PPARγ重組腺病毒（Ad／PPARγ）和 MED1重組腺病毒（Ad／MED1）載體由實驗室構建。

1．2 重組腺病毒的擴增 用重組腺病毒原液先感染少量HEK293a細胞，36～48h后，約80%的細胞漂浮時，收集細胞，離心棄上清，加入少量DMEM培養液懸浮，在甲醇干冰浴和37℃水浴鍋中反復凍融3次，離心取病毒上清。……