超聲波誘導(dǎo)鈣黃綠素脂質(zhì)體緩釋特性評價

陳國明，劉盛平，羅亞芳

(重慶理工大學(xué) a.藥學(xué)與生物工程學(xué)院; b.化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054)

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超聲波誘導(dǎo)鈣黃綠素脂質(zhì)體緩釋特性評價

陳國明a，劉盛平a，羅亞芳b

(重慶理工大學(xué) a.藥學(xué)與生物工程學(xué)院; b.化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054)

在脂質(zhì)體藥物緩釋研究中，超聲波因其無創(chuàng)、易控制等優(yōu)點而備受關(guān)注。采用去離子水制備聚乙二醇修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體，并用負(fù)染色法對超聲波作用前后的脂質(zhì)體外觀形態(tài)進行了透射電鏡觀測。同時采用阻抗分析法測定脂質(zhì)體溶液的阻抗變化，以評價超聲波作用后脂質(zhì)體內(nèi)包藥物的釋放特性。結(jié)果表明：超聲波可促進多層脂質(zhì)體膜的融合形成單層膜結(jié)構(gòu)，最終將脂質(zhì)體破壞成微小膠束，并且可通過調(diào)整超聲波的作用時間和功率，控制藥物的釋放速率。

脂質(zhì)體；超聲波；阻抗；藥物緩釋

脂質(zhì)體(liposome)藥物緩釋系統(tǒng)是目前最先進的第4代靶向給藥系統(tǒng)，被喻為“生物導(dǎo)彈”。它是直徑幾十納米到幾十微米不等的類似于細(xì)胞的微小球狀物，可以包裹各種類型的藥物，具有優(yōu)良的生物相容性和仿生性，能有效提高藥物的靶向性，降低藥物毒副作用，提高生物利用度，是提高藥物療效的重要途徑。自1971年 Gregoriadis G等[1]首次將脂質(zhì)體作為藥物載體進行研究以來,脂質(zhì)體一直都是緩釋藥物研究的主要熱點之一。

脂質(zhì)體作為靶向給藥載體，目前有基于pH值、溫度、光、電場、磁場、超聲波等敏感原理控制其內(nèi)藥物緩釋[2-7]的方式。其中由于超聲波能在體內(nèi)聚焦，為非侵入式方式，且可方便地通過調(diào)整其頻率、功率、作用時間等進行控制，因此尤其受到人們重視。研究者們一般選用醫(yī)用超聲(1～10 MHz)[8-9]和低頻超聲(20～100 kHz)[10-11]作為藥物釋放誘因。也有研究者認(rèn)為低頻超聲比醫(yī)用超聲更有效[11]。但到目前為止，超聲波誘導(dǎo)脂質(zhì)體藥物釋放的機理尚未明確。本文采用頻率為28 kHz的低頻超聲波作為外界刺激，研究其對脂質(zhì)體藥物釋放的影響。

熒光百分比法[12]是評價脂質(zhì)體藥物釋放特性的傳統(tǒng)方法，但藥物必須具有熒光特性，這就限制了該方法的應(yīng)用范圍。本研究采用阻抗法測量藥物釋放前后脂質(zhì)體溶液的阻抗值變化，根據(jù)事先測定的藥物濃度與阻抗值之間的對應(yīng)關(guān)系，準(zhǔn)確、唯一地計算出的藥物釋放量，進而精確確定脂質(zhì)體藥物釋放百分比[13]。

本研究以油酰磷脂酰膽堿(POPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇 (DPPE-PEG2000)以及膽固醇按不同摩爾比混合，采用冷凍溶解法結(jié)合微濾膜擠出法制備了聚乙二醇(PEG)修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體。采用低頻超聲波(28 kHz)作為外界刺激，用透射電子顯微鏡觀察了超聲波作用前后的形貌變化，并使用阻抗法評價鈣黃綠素脂質(zhì)體的釋放特性。

1. 試劑與方法

1.1 試劑

油酰磷脂酰膽堿(POPC)和二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(DPPE-PEG2000)均購自AVT公司。膽固醇，黃綠素(3,3’-雙(甲亞胺二乙酸)熒光素)，氫氧化鈉，丙酮，乙醇，乙醚，氯仿，鉬酸銨，磷脂酶C均購自日本和光純藥株式會社。Formvar(粉末)購自SPI公司，瓊脂糖凝膠4B(Sephadex 4B)購自Sigma。由于鈣黃綠素難溶于水，故將其以1：4的摩爾比溶解于NaOH溶液配得100 mM的鈣黃綠素鈉后再將其包覆于脂質(zhì)體內(nèi)。

1.2 脂質(zhì)體的制備

本研究所用脂質(zhì)體樣本采用冷凍溶解-微濾膜擠出法制得[13]。脂膜組分POPC、DPPE-PEG2000和膽固醇的摩爾百分比為9∶1∶10。所加鈣黃綠素溶液濃度為100 mM，尺寸調(diào)整用聚碳纖維膜的孔徑為100 nm。所得脂質(zhì)體溶液用去離子水經(jīng)瓊脂糖凝膠(Sephadex 4B)濾除未包入的鈣黃綠素，最后用膽堿氧化酶·DAOS法檢測脂質(zhì)體的濃度。

1.3 透射電子顯微鏡觀測

將脂質(zhì)體樣品滴加到親水化處理后的電鏡專用銅網(wǎng)(覆有fomvar膜和碳膜)表面，再經(jīng)2%的鉬酸銨水溶液于銅網(wǎng)上進行負(fù)染色，在空氣中干燥后放進透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit BioTWIN, FEI, USA)中對脂質(zhì)體粒徑大小和形態(tài)進行觀測并拍照[13]。透射電鏡加速電壓為120 kV。

1.4 阻抗測試與評價

采用安捷倫4292A阻抗分析儀(安捷倫，日本)進行脂質(zhì)體的阻抗測試分析。所用電極為2個不銹鋼電極(CUY560, Nepa Gene,日本)，電極間距為5 mm，其在溶液中的位置如圖1所示。由于阻抗對樣本溫度敏感，因此整個阻抗測量均在恒溫器(IN602W, 大和科學(xué)株式會社，日本)中進行，設(shè)定溫度為25 ℃。

脂質(zhì)體的釋放率的阻抗評價采用濃度百分比法[14]，如式(1)所示。

(1)

式(1)中：R(t)是百分比釋放率；Mt為t時刻釋放出的藥物濃度；Mini為初始藥物濃度；Mfin是脂質(zhì)體內(nèi)藥物完全釋放時的藥物濃度，此處為脂質(zhì)體內(nèi)加入足量Triton X-100后將脂質(zhì)體完全破壞后得到的濃度。

圖1 阻抗測試裝置示意圖

圖2 阻抗與鈣黃綠素溶液濃度關(guān)系曲線

為了根據(jù)所測得的阻抗值確定相應(yīng)的藥物濃度，本文在使用阻抗評價之前，建立了阻抗與藥物濃度之間的對應(yīng)關(guān)系，如圖2所示。雖然藥物濃度與阻抗為非線性關(guān)系，但通過該曲線仍可唯一確定脂質(zhì)體釋放藥物的濃度。

1.5 溫度對脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響評價

本文研究了溫度對制備聚乙二醇修飾的鈣黃綠素脂質(zhì)體釋放特性的影響。將脂質(zhì)體樣品溫度從25 ℃升高至35 ℃，恒溫10 min，然后冷卻到25℃，恒溫10 min；接著將溫度升高至45 ℃恒溫10 min，又重新降溫至25℃并保持10 min；然后將溫度升至55 ℃，恒溫保持10 min后冷卻至25 ℃；10 min后繼續(xù)升溫至65 ℃，恒溫10 min，最后冷卻至25 ℃并恒定10 min。整個過程中實時連續(xù)檢測其阻抗值，評價溫度(35，45，55，65 ℃)對其鈣黃綠素釋放率的影響。

1.6 超聲波誘導(dǎo)藥物釋放

本研究使用超聲破碎機(UR-20P, TOMY精工株式會社,日本)，額定頻率為28 kHz, 作為加速脂質(zhì)體樣品內(nèi)包鈣黃綠素的釋放速率的外界因素，實驗操作示意圖如圖3(a)所示。圓底試管中盛有3 mL脂質(zhì)體溶液，超聲探頭垂直插入脂質(zhì)體溶液中，探頭頂端位于液面下4 mm處，超聲波的功率為18 W(約366.7 W/cm2)。為了抑制溶液溫度的持續(xù)上升，超聲處理在恒溫器(IN602W, 大和科學(xué)株式會社，日本)中進行，其溫度設(shè)定在25 ℃，且超聲波以1/2的占空比施加，即超聲施加1 min，停2 min，施加方式如圖3(b)所示。本文中所指的超聲時間是指實際的施加超聲時間，不包括停頓休息的時間。經(jīng)激光溫度計(TEMPERRATURE HiTESTER 3445, HIOKI,日本)檢測，溶液溫度值最高未超過60 ℃。阻抗測量為脂質(zhì)體樣本溶液溫度恢復(fù)到25 ℃時進行的。

圖3 超聲波處理裝置

2 結(jié)果與討論

透射電子顯微鏡(TEM)可看到光學(xué)顯微鏡下無法看清的納米級微細(xì)結(jié)構(gòu)。圖4為超聲波作用前的脂質(zhì)體TEM照片。該圖表明所制備的脂質(zhì)體為粒徑范圍約80～200 nm的球形或橢球形。右上角放大圖可清晰地看到其多層膜結(jié)構(gòu)，且膜厚度約為4～5 nm。圖5為超聲波作用10 min后的脂質(zhì)體TEM照片。圖中可見直徑約200～400 nm的脂質(zhì)體，而之前80～200 nm的脂質(zhì)體數(shù)量幾乎不可見。可能是由于多層膜脂質(zhì)體在超聲波作用下，脂質(zhì)體膜層相互融合，從而形成較大直徑的單層膜脂質(zhì)體。圖6為超聲波作用20 min后的脂質(zhì)體TEM照片。圖中可見大量長度約30 nm以下的細(xì)長棒狀物，表明在超聲波的進一步作用下，大尺寸脂質(zhì)體被破壞并形成小脂質(zhì)體或膠束。該結(jié)果表明：當(dāng)脂質(zhì)體為多層膜結(jié)構(gòu)時，超聲波可促進-膜間相互融合，形成層數(shù)更少，甚至是單層膜的結(jié)構(gòu)。而當(dāng)脂質(zhì)體為單層膜結(jié)構(gòu)時，超聲波則表現(xiàn)為破碎作用，將脂質(zhì)體破碎為更小的脂質(zhì)體或膠束。

圖4 超聲波作用前的脂質(zhì)體,bar=200 nm

圖5 超聲波作用10 min后的脂質(zhì)體TEM照片,bar=200 nm

圖6 超聲波作用20 min后的脂質(zhì)體TEM照片,bar=50 nm

溫度對脂質(zhì)體膜的通透性有重要的影響。一般說來，溫度越高，膜的流動性就越高，就越有利于脂質(zhì)體內(nèi)部藥物的釋出。為確認(rèn)究竟是超聲波的機械效應(yīng)還是熱效應(yīng)引起的藥物釋放，本研究對所配置的脂質(zhì)體釋放特性的溫度影響進行了評價。將脂質(zhì)體樣本依次在25，35，45，55，65 ℃條件下保持10 min，再將樣本溫度恢復(fù)到25 ℃，通過阻抗測量實時監(jiān)測整個反復(fù)升溫降溫的過程。如圖7所示，標(biāo)有1～5的水平段，為25 ℃時的阻抗值，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，脂質(zhì)體的阻抗值明顯降低，但當(dāng)溫度恢復(fù)到25 ℃時，阻抗值亦基本恢復(fù)到最初25 ℃時的大小，未發(fā)生顯著變化。

本研究所用脂質(zhì)體為POPC、DPPE-PEG2000和膽固醇構(gòu)成(分子結(jié)構(gòu)見圖8)，其中POPC是構(gòu)成脂質(zhì)體雙分子層膜的主要成分，它構(gòu)成了脂質(zhì)體膜的骨架，可在其上進一步鑲嵌各種功能物質(zhì)，從而達到調(diào)整脂質(zhì)體膜特性目的。DPPE-PEG2000的雙鏈端鑲嵌于脂質(zhì)體膜內(nèi)，其具有的較長碳鏈端則伸向溶液中，在脂質(zhì)體表面形成一層類似于細(xì)胞表面“糖被”的結(jié)構(gòu)，增加了脂質(zhì)體相互凝聚融合的難度，且可避免脂質(zhì)體被人體免疫系統(tǒng)識別，延長脂質(zhì)體的血液循環(huán)時間[15]。而膽固醇則是鑲嵌在脂質(zhì)體膜中的另一種重要物質(zhì)。在較高溫度時，膽固醇分子限制脂質(zhì)分子脂酰鏈末端的甲基運動,減少qauch構(gòu)象，降低膜流動性[16]。通過調(diào)整膜中膽固醇的配比，可改變脂質(zhì)體膜的相變溫度與流動性。本文所用脂質(zhì)體為POPC、DPPE-PEG2000和膽固醇按摩爾比9∶1∶10配置，膽固醇含量達50%，極大地提高了相變溫度。實驗表明在65 ℃以下時，溫度對膽固醇含量為50%的脂質(zhì)體膜的通透性并無顯著影響。實驗結(jié)果同時表明，運用阻抗法可實現(xiàn)連續(xù)在線實時監(jiān)測脂質(zhì)體的釋放特性。為了限制脂質(zhì)體溫度升高，研究中采用圖3(b)所示的PWM波控制超聲波的施加。經(jīng)激光溫度計實時檢測，脂質(zhì)體樣本的最高溫度小于60 ℃。即超聲波作用所引起的溫度提升不足以引起脂質(zhì)體內(nèi)藥物的有效釋放，可進一步認(rèn)為超聲波作用下藥物釋放均是由超聲波的機械效應(yīng)所引起。

圖7 溫度對脂質(zhì)體釋放特性影響的阻抗圖

圖8 脂質(zhì)體膜主要組分POPC、DPPE-PEG2000，膽固醇的分子結(jié)構(gòu)式

機械效應(yīng)是超聲波的原發(fā)效應(yīng)，不管何種強度的超聲波均產(chǎn)生該效應(yīng)。在超聲波作用下，各質(zhì)點受到交替變化的壓縮和伸張，產(chǎn)生正壓和負(fù)壓，由此得到巨大的加速度。脂質(zhì)體在此作用力作用下，則可能在脂膜上打開臨時通道，使得其內(nèi)包藥物釋放到脂質(zhì)體外液相環(huán)境中。圖9是脂質(zhì)體分別在超聲波發(fā)生器(額定工作頻率28 kHz)輸出功率為10 W, 14 W, 18 W時鈣黃綠素的釋放特性的阻抗評價曲線。由圖9可見，未施加超聲波時的釋放曲線近似為一水平直線，表明脂質(zhì)體內(nèi)的鈣黃綠素幾乎沒有釋放。在受到超聲波刺激時，脂質(zhì)體內(nèi)所包覆的鈣黃綠素快速釋出，其釋放速率隨超聲波功率呈正相關(guān)，功率越大，釋放速率越快。隨著超生作用時間的延長，脂質(zhì)體內(nèi)包藥物率呈負(fù)指數(shù)增長。而當(dāng)釋放率在60%以下時，釋放率和超生時間可近似為線性關(guān)系。由此可見，施加超聲波可促進脂質(zhì)體內(nèi)所包裹藥物的釋放，并可通過調(diào)整超聲波的功率以及作用時間可以控制藥物釋放速率。

圖9 不同功率超聲波(28 kHz)作用下鈣黃綠素脂質(zhì)體的釋放特性曲線

3 結(jié)束語

本文對低頻超聲波(28 kHz)作用前后的脂質(zhì)體形貌進行了電子顯微鏡觀察。結(jié)果表明，低頻超聲波能促進多層膜脂質(zhì)體融合稱為單層膜脂質(zhì)體，并可進一步將單層脂質(zhì)體破碎成膠束。通過調(diào)整超聲波的功率和作用時間以控制脂質(zhì)體內(nèi)藥物釋放速率。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Ultrasound Induced Release Property Evaluation of Calcein Encapsulated Liposome

CHEN Guo-minga, LIU Sheng-pinga, LUO Ya-fangb

(a.College of Pharmacy and Biological Engineering; b.College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

In the study of liposome controlled release, ultrasound has been attracted great interests because of its merits of non-invasive and easily to be controlled. Calcein trapped PEG-liposome was prepared with de-ionized water and morphology of the liposomes before and after ultrasonication were studied by transmission electron microscopy (TEM) with negative staining method. An impedance evaluation method was employed to monitor the impedance change of liposomes thus to evaluate the liposome’s release property. Results show that ultrasound could accelerate membrane fuse of liposome’s multilayer and would destroy liposomes into micelles finally. By adjusting ultrasound power and ultrasonication time, the release rate could be well controlled.

liposome; ultrasound; impedance; controlled drug release

2015-01-20 基金項目：重慶市自然科學(xué)基金資助項目(CSTC,2011BB5111)

陳國明(1979—)，男，浙江衢州人，副教授，主要從事藥物緩釋控制研究。

陳國明，劉盛平，羅亞芳.超聲波誘導(dǎo)鈣黃綠素脂質(zhì)體緩釋特性評價[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015(3):52-57.

format：CHEN Guo-ming, LIU Sheng-ping, LUO Ya-fang.Ultrasound Induced Release Property Evaluation of Calcein Encapsulated Liposome[J].Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science,2015(3):52-57.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2015.03.011

R944.9

A

1674-8425(2015)03-0052-06