WISP-1基因的RNAi技術在膝骨關節炎中的治療作用

劉波 宮宇寶 齊欣

WISP-1基因的RNAi技術在膝骨關節炎中的治療作用

劉波 宮宇寶 齊欣

目的 通過RNA 干擾技術阻斷人骨關節炎呈現OA滑膜細胞WISP-1信號通路，探索其在骨關節炎治療中的應用前景。方法根據干擾RNA 設計原則，合成并構建WISP-1 shRNA質粒表達載體。將質粒表達載體轉染入滑膜細胞并分組。轉染24 h后測定細胞β-catenin、WISP-1、MMP-3 mRNA 相對表達水平。結果 OA滑膜細胞經過RNAi后WISP-1、MMP-3表達明顯減少,意味著干擾WISP-1使得Wnt/β-catenin通路對MMP-3的誘導作用降低，也進一步證實了Wnt /β-atenin/WISP-1通路的存在。因此，WISP-1可以作為治療骨關節炎一個理想的靶點。結論 本實驗中我們觀察到，OA滑膜細胞經過RNAi后MMP-3表達明顯減少,意味著Wnt/β-連環蛋白信號通路對MMP-3的誘導作用降低，進一步證實了Wnt/β-連環蛋白（catenin）/WISP-1通路的存在。

骨關節炎；RNA干擾；WISP-1

骨關節炎（OA）是一種慢性關節疾病，特征是關節軟骨，軟骨下骨的改變，以及可變二次滑膜炎癥的緩慢進行性退化。該疾病的只要病因是未知的，但是肥胖、遺傳以及損傷等因素已證實與OA發生的風險相關[1-2]。在OA中，細胞外基質（EGM）合成和分解失衡導致關節軟骨功能喪失及關節軟骨的破壞。最新研究表明：WISP-1具有促進關節軟骨破壞的作用。WISP-1在正常軟骨和滑膜中幾乎不表達，而在退變的軟骨及滑膜（如OA）中WISP異常增高，通過誘導MMPs及aggrecanases的分泌而促進膠原蛋白與蛋白多糖的分解[3]。因此WISP-1可能為OA的治療提供了一個新靶點，通過抑制WISP-1的基因表達，有可能開發出一種預防、治療骨性關節炎的新療法。因此我們使用人OA膝關節滑膜組織，探討RNAi技術調控WISP-1表達治療骨關節炎的可能性,對膝骨關節炎的治療進行摸索。

1 材料與方法

1.1 shRNA質粒表達載體構建

由上海吉凱基因化學技術有限公司根據GenBank中WISP-1 mRNA序列（NM-003882. 3 ），設計并合成對應于WISP-1的干擾序列，包含針對靶基因序列（5，-AAGTCACCAAACATGTTCTAG-3，、5，-AAGTTGTCAGAAATCCTAATG-3，、5，-AACAACCTGTGG CCTAGGTAT-3，）的3個RNAi克隆，靶點設計在不同轉錄本的共有區段。

1.2 人骨關節炎成纖維滑膜細胞準備

人骨關節炎成纖維滑膜細胞（北京清源浩生物科技有限公司，HFLS-OA）消毒后（紫外線照射40min），將細胞懸液移入10 ml離心管，緩慢加入4 ml培養液（DMEM），離心（1 000 r/min，5min），調整細胞濃度，將人骨關節炎成纖維滑膜細胞以1×104細胞/孔種植于96孔板中，并在每孔中加入培養液2 ml。將96孔板置于37℃，5％ CO2，培養箱中培養中孵育24小時。

1.3 重組質粒轉染人滑膜細胞

細胞培養后，分成3組，分別設空白對照組、轉染試劑對照、實驗組。（1）空白對照組，單純培養液；（2）陰性對照質粒；（3）WISP-1 shRNA質粒。

1.4 基因提取及基因表達檢測

培育24h后收集各組滑膜細胞，參照說明書，使用Trizol試劑收集總的RNA。用逆轉錄試劑盒（Takara, Japan）將收集提取的RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taqkit （Takara, Japan）試劑盒，采用熒光實時定量分析系統Mx3005P （Stratagene, USA）進行qRT-PCR測量。為了分析結果，基因表達值與管家基因β-連環蛋白（catenin）對照，并使用△Ct方法進行計算。然后各自基因與對照組參考出標準值，最后獲得基因表達的倍數值。

1.5 統計學處理

所有數據均采用SPSS 19.0統計軟件。數據使用（均值±標準差）表示。實驗組和對照組之間的差異采用配對t檢驗，將P＜0.05定義為有統計學差異。

2 結果

2.1 各組滑膜細胞中WISP-1 mRNA表達情況

將各組滑膜細胞提取的總RNA逆轉錄并進行電泳驗證后，采用qRT-PCR法對各組滑膜細胞WISP-1的mRNA表達情況進行檢測，RT-PCR結果表明β-連環蛋白（catenin） （內參）/WISP-1的PCR產物溶解曲線均呈單峰，說明實驗特異性好。記錄各實驗組的WISP-1表達量PCR結果，發現孵育24小時之后空白對照組和負對照組無明顯變化，實驗組WISP-1表達量均逐步明顯減少，表達量約為對照組的77％，見圖1。

圖1 各組滑膜細胞的WISP-1 mRNA相對表達

2.2 各組滑膜細胞中MMP-3表達情況。

實驗組滑膜細胞的MMP-3相對表達水平（β-連環蛋白（catenin）為內參）下降，見圖2。MMP-3表達明顯減少,意味著Wnt/β-連環蛋白（catenin）信號通路對MMP-3的誘導作用降低，進一步證實了Wnt/β-連環蛋白（catenin）/WISP-1通路的存在。

3 討論

OA是一種在中、老年人群中常見的緩慢進展的關節退行性疾病，以關節軟骨退變、磨損和骨贅生成為特征。在骨性關節中，細胞外基質（EGM）合成和分解失衡導致關節軟骨功能喪失及關節軟骨的破壞。軟骨細胞基質代謝由一系列細胞因子、降解酶和生長因子來調控，其中一部分因子通過體內或體外抑制或活化的方法己經被證實可以減緩或逆轉骨性關節炎。Wnt/β-連環蛋白（catenin）信號通路是目前研究最廣泛的通路之一，他與人體生長發育各個方面息息相關。大量研究證實，Wnt/β-連環蛋白（catenin）信號與人骨關節炎的發生、發展有著重要的關聯。此通路的異常表達將導致人體骨骼代謝失平衡，最終形成OA。

圖2 各組滑膜細胞的MMP-3相對表達水平

本研究中發現，OA滑膜細胞經過RNAi后WISP-1基因表達水平明顯降低（圖1），提示Wnt/β-連環蛋白（catenin）/WISP-1信號通路在OA中被激活，可能與軟骨破壞、滑膜損傷有關。

MMPs是人體內破壞關節軟骨細胞外基質（ECM）的最主要生物酶的之一，以MMP-3、MMP-13與KOA發生的發生最為緊密。軟骨細胞通過合成和分解代謝維持ECM的動態平衡，合成減少/分解增加都將導致ECM趨向降解，最終引發關節炎。

本實驗中我們觀察到，OA滑膜細胞經過RNAi后MMP-3表達明顯減少,意味著Wnt/β-連環蛋白信號通路對MMP-3的誘導作用降低，進一步證實了Wnt /β-連環蛋白（catenin）/WISP-1通路的存在。

[1]Sharma L，Kapoor D，Issa S，et al.Epidemiology of osteoarthritis：an update[J].Curr Opin Rheumato，2006（18）：147-156.

[2]Goldring MB，Goldring SR.Osteoarthritis[J].Cell Physiol，2007（213）：626-634.

[3]Blom A.B，Brockbank S.M.，van Lent P.L.，et al.Involvement of the Wnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis：Prominent role of Wnt-induced signaling protein[J].Arthritis＆Rheumatism，2009，60（2）：501-512.

RNAi Silencing of WISP-1 Gene in the Treatment of Osteoarthritis

LIU Bo GONG Yubao QI Xin, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China

Objective To block human synovial cells WISP-1 signaling pathway by using RNA interference, and explore its application prospect in the treatment of osteoarthritis. Methods According to the design principles of RNA interference, we synthesis and build the plasmid expression vector of WISP-1 shRNA. The plasmid expression vector was transfected into the synovial cells. After 24h, the relative expression levels ofβcatenin,WISP-1, MMP-3 mRNA were measured. Results OA synovial cells after silencing WISP-1, MMP-3 expression was signifcantly reduced, which means that silencing WISP-1 could lower the effect of Wnt / β-catenin pathway on MMP-3, also confirmed the preent of Wnt/β-atenin/WISP-1 pathway. Therefore, WISP-1 can be used as a ideal target in the treatment of osteoarthritis.Conclusion In this experiment, we observed that the expression of MMP-3 after OA was signifcantly decreased, which means that the Wnt/ MMP-3 RNAi signal pathway was decreased, which was confrmed by the presence of Wnt/β- catenin/WISP-1pathway.

Osteoarthritis, RNA interference, WISP-1

R684.3

A

1674-9308（2015）30-0062-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.30.045

130021 吉林省長春市吉林大學第一醫院

齊欣，E-mail：dr.qixin＠jlu.edu.cn

吉林省自然科學基金項目《人早期膝關節骨性關節炎wisp-1表達與臨床表現的相關性研究》（面上項目：201215039）