顯色劑加入方式及結果計算方法對土壤磷酸酶測定結果的影響

貝美容+羅雪華+楊紅竹

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所 海南儋州 571737）

摘 要 為探討有色顯色劑的加液方式及加入量對顯色后溶液吸收值的影響、標準曲線的繪制及結果計算方法對土壤磷酸酶測定值的影響，取廣東橡膠園0～20 cm土樣為材料，以磷酸苯二鈉為基質，酶解土壤釋放出酚，與顯色劑氯代二溴對苯醌亞胺反應，以標準曲線法求出樣品測試液的酚濃度，比較以不同加液方式加入不同量的顯色劑對溶液吸收值的影響，同時比較用直線或一元二次曲線等兩種標準曲線回歸方程對樣品測試液酚濃度的影響。結果表明：以膠頭滴管滴加或以移液槍用多次重復使用過的吸嘴加入顯色劑，顯色后溶液吸收值變異系數達3.33%～6.44%，而以活塞式定量加液器加入，其變異系數在1.28%以下，且隨著加入量增大變異系數降低至0.51%，重現性好；當配制的標準曲線濃度范圍較寬且相應吸收值較高（接近0.9），以曲線法求得的標準曲線回歸方程決定系數（R2=0.999 8）大于直線回歸的（R2=0.999 7），且曲線法求出的土壤無基質對照及試劑空白酚濃度比直線法更有實際意義。

關鍵詞 土壤磷酸酶 ；顯色劑 ；定量加液器 ；標準曲線 ；結果計算

分類號 O657

Abstract Effects of color development reagent dosing methods and dosing volumes on absorbance were investigated in this study， and effects of calculation methods on final values were also discussed in this study. Soil samples were collected in Guangdong rubber plantation from 0～20 cm layer， benzene disodium phosphate as the reactant， and chlorinated dibromo benzoquinoneimine as the color development reagent， the phenol concentration of tested sample solution be calculated using the standard curve methods. The effects of different dosing methods and dosing volumes of color development reagent on absorbance were compared and the phenol concentrations of tested sample solution were compared with linear or quadratic curve regression equation. The results showed that the coefficient of variation （CV） of the absorbance value ranged from 3.33% to 6.44% after adding different amounts of color development reagent using rubber dropper or pipette with continuous used tips， and CV was less than 1.28% using a piston dispenser， and CV was reduced to 0.51% with the amounts of the color reagent increasing. When standards of desired concentration range were wide， and the highest point of the standard series had a higher absorbance value， for example， the absorbance value of the highest standard closed to 0.9 in this experiment， the coefficient of determination of the standard curve regression equation based on a quadratic fit （R2=0.999 8） was higher than on a linear fit（R2=0.999 7） ， and the phenol concentration of tested blank without disodium phenyl phosphate and the reagent blank were more meaningful using the regression equation based on a quadratic fit than based on a linear fit.

Keywords soil phosphatase ； color reagent； piston dispenser ； standard curve ； result calculation

土壤有機磷是土壤全磷的重要組成部分，約占土壤全磷的30%～80%[1-2]，但有機磷必須在土壤磷酸酶的作用下轉化為無機磷后才能被植物吸收利用，因而土壤磷酸酶的活性直接影響土壤中磷的有效性。而土壤磷酸酶活性的準確定量是正確評價土壤有機磷轉化強度和方向的前提和基礎。常用的土壤磷酸酶活性測定方法是通過向土壤中添加苯基磷酸鹽等基質，然后以比色法測定在磷酸酶的作用下水解后所生成的有機基團即苯酚的量，即為酶促基質形成產物的數量[2-5]。

由于土壤中存在一些與基質分解產物相似的化合物（如酚等）及基質自發分解的產物，它們將直接影響結果的準確性，在測定土壤磷酸酶活性時，都必須設置無基質對照和無土壤對照，計算酶活性時從試驗樣品數據中減去對照樣品的，但在具體的顯色、比色等操作步驟中，由于顯色劑本身有顏色，顯色劑的加入量、加液方式、參比溶液的選擇，均會影響酶活性測定結果的準確性[6]，甚至因參比溶液選擇不當導致結果計算時出現土壤酶活性為負值的現象。針對上述問題， 我們從顯色劑的配制、移取方法、參比溶液的選擇及標準曲線繪制、結果計算等方面對該法作了一些研究，供分析實驗人員參考，以提高分析樣品的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

廣東橡膠園土壤0～20 cm土樣，3種不同的土質，基本情況見表1。

1.1.2 儀器

恒溫培養箱；Lambda系列紫外/可見分光光度計。

1.1.3 試劑、標準系列

試劑均為分析純；水為蒸餾水。甲苯；pH 5.0醋酸鹽緩沖液；0.5%的基質溶液；pH 9.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液；顯色劑；1 g/L酚原液；10 mg/L酚工作液。

1.2 方法

1.2.1 試劑、標準系列的配制

（1）pH 5.0醋酸鹽緩沖液：分別取貯備液A 14.8 mL、貯備液B 35.2 mL，以水稀釋至100 mL；貯備液A：0.2 mol/L醋酸溶液，即取95%的醋酸11.55 mL加水稀釋至1 L；貯備液B：0.2 mol/L醋酸鈉溶液，即取16.4 g醋酸鈉（CH3COONa）或27.2 g CH3COONa·3H2O，加水溶解后稀釋至1 L。

（2）0.5%的基質溶液：取5.826 g苯磷酸二鈉（C6H5PO4Na2·2H2O） 溶于pH 5.0的醋酸鹽緩沖液并稀釋至1 L。

（3）pH 9.6硼砂-氫氧化鈉緩沖液：分別取貯備液C 50 mL、貯備液D 23 mL，以水稀釋至200 mL；貯備液C：0.05 mol/L硼砂溶液，即取19.05 g硼砂（Na2B4O7·10H2O）加水溶解后稀釋至1 L；貯備液D：0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，即取8.0 g 氫氧化鈉（NaOH）加水溶解后稀釋至1 L。

（4）顯色劑：取0.062 5 g 2.6-二溴苯醌氯酰亞胺（C6H2Br2ClNO），用40 mL 95%乙醇溶解（原方法[5]：0.125 g 2.6-二溴苯醌氯酰亞胺用10 mL 95%乙醇溶解），貯于棕色瓶中，存放在冰箱里，保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用（最好現配現用）。

（5）1 g/L酚原液：取1 g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1 L，貯于棕色瓶中。

（6）10 mg/L酚工作液：取10 mL 酚原液稀釋至1 L。

1.2.2 測定原理

本法基于以苯磷酸二鈉為基質，在pH 5.0醋酸鹽緩沖液的酸性條件下，使酶解土壤釋放出的酚與氯代二溴對苯醌亞胺試劑反應生色，比色后按標準曲線法求出游離的酚量，用以表示酶的活性。

1.2.3 酶活性的測定

標準系列溶液的測定：取10 mg/L酚工作液0、0.5、1、2、3、5、7、8、9 mL置于25 mL容量瓶中，使用定量加液器每瓶分別加入2.5 mL pH 9.6的硼砂-氫氧化鈉緩沖液和1 mL顯色劑，顯色后以水稀釋至刻度，30 min后，于578 nm波長處比色，用1 cm比色皿，以蒸餾水作參比溶液調節儀器零點，測定其吸收值，該標準系列溶液相應酚濃度為：0、0.2、0.4、0.8、1.2、2、2.8、3.2、3.6 mg/L。

樣品的測定：稱取過1 mm篩的風干土樣2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，輕輕搖動，15 min后，加入10 mL 0.5%的基質溶液，仔細搖勻后以保鮮膜封口，放入37 ℃恒溫箱培養24 h。取出后加入90 mL水，搖勻，吸取10 mL離心，取1 mL清液于25 mL刻度試管，然后按繪制標準曲線所述方法顯色，此液即為加基質樣品測試液（簡稱為加基質樣品）；同時，每個土樣做無基質對照實驗，即以10 mL pH 5.0醋酸鹽緩沖液代替10 mL基質溶液，其余操作與加基質樣品同樣顯色，此液為無基質對照測試液（簡稱為無基質對照），以排除土壤中原有的酚對實驗結果的影響；同時與樣品實驗相同方法做無土對照實驗，即不加入土壤，其余操作與加基質樣品同樣顯色，此液為無土對照測試液（簡稱試劑空白），以檢查試劑純度和基質自生分解情況，每個樣品重復3次。

因為顯色劑本身是有顏色的，為比較不同量的顯色劑、不同加液方式對溶液吸收值的影響，分別用膠頭滴管、移液槍及活塞式定量加液器加入0.5、1、1.5 mL等不同量的顯色劑，以水定容至25 mL，測定其吸收值，每個處理重復4次。

2 結果與分析

2.1 顯色劑不同加入法對溶液吸收值的影響

不同量的顯色劑、不同加入方法對溶液吸收值的影響結果見表2。從表2中可以看出，不論是哪種加入法，隨著顯色劑加入量的不斷增加，溶液吸收值均不斷增大，因此在酶活性測定過程中必須十分嚴格控制顯色劑的加入量[7]，以準確加入所需的顯色劑用量。

從表2中還可看出，用膠頭滴管和移液槍加入顯色劑，溶液吸收值的變異系數均大于3.33，且隨著顯色劑加入量的增大而增加至6.44，這可能是由于滴管加入，是由拇指和食指出力控制一滴一滴地加入，而每滴之間由于手控制力的差異，同時由于顯色劑濃度高、且溶劑為高濃度易揮發的酒精，每滴之間微量的差異將導致顯色后溶液吸收值的較大差異；而移液槍本身是精密儀器，但其塑料吸嘴由于重復使用，吸嘴尖端殘留量不一及內壁易掛水珠等因素，致使移液槍加入法溶液的吸收值重復性也較差。

而活塞式加液器是利用注射器式針筒的柱塞往復運動和進水口、出水口兩個單向活塞使液體定量、定向運動、進行加液，所加試液在試液導出管內相對較密閉，不存在液體揮發和掛壁現象，所以顯色后溶液吸收值變異系數在1.28%以下，且隨著顯色劑加入量由0.5 mL增至1.5 mL，其變異系數反而減小，重復性更好，故我們優選活塞式定量加液器；同時降低顯色劑的配制濃度，即取0.062 5 g氯代二溴對苯醌亞胺溶解于40 mL 95%的乙醇、但顯色劑的加入量由文獻的5滴[5]（約0.25 mL）擴大至1 mL，而總的氯代二溴對苯醌亞胺加入量保持不變，以減小測試誤差，提高樣品分析準確性。

2.2 土壤磷酸酶活性計算方法

本實驗測得標準系列溶液顯色后的吸收值分別為0.171、0.215、0.259、0.34、0.422、0.575、0.728、0.804、0.890。在由標準系列酚濃度及其相應吸收值求樣品測試液的酚濃度時，在如今計算機普及的情況下，不用坐標紙繪圖法，而參照一元線性回歸在比色分析中的應用方法[8]，在Excel 2003或2007軟件中，以標準系列溶液酚濃度為自變量（x），相應吸收值為因變量（y），插入XY散點圖后繪得回歸線，再選中該回歸線后在添加趨勢線的回歸分析類型選項中，選擇線性或多項式及相應的公式、R平方值等選項后，求得直線回歸方程：y=0.197 2 x+0.178 2，R2=0.999 7，或一元二次曲線回歸方程：y=-0.002 3 x2+0.205 5 x+0.174 8，R2=0.999 8。測定出的3種土壤加基質樣品、無基質對照及試劑空 白顯色后溶液的吸收值見表3。

由表3可知，3種土樣的A無及試劑空白A0雖然都較高（達到0.17），且與上述標準空白接近，說明3種土樣的無基質對照及試劑空白的酚含量接近標準空白，其吸收值較高是由于顯色液帶有顏色而引起的。

由各土樣顯色后溶液吸收值依據上述標準曲線回歸方程求解擬合，求出其相應酚濃度C，平均值見表3，最后根據公式⑴求出各土壤樣品磷酸酶活性，見表4。

由表4可知，用直線回歸方程（簡稱直線法）求出3種土樣的無基質對照及試劑空白的酚濃度在-0.006～-0.020，全部為負值，而由曲線回歸方程（簡稱曲線法）求出3種樣品的無基質對照及試劑空白的酚濃度在-0.002～0.011，其中也出現了負值，這可能是回歸方程引入的一個固定的誤差[9-10]，并非負濃度，說明3種土樣本身所含酚類物質都較低，基質的自發分解也很弱，但曲線法求出3種土樣的無基質對照及試劑空白的酚濃度比直線法更接近于正值，更有實際意義；且由于本實驗配制的標準曲線濃度范圍較寬，最高點酚濃度為0.36 mg /L，其吸收值相應較高（接近0.9），以曲線法求得的標準曲線回歸方程決定系數（R2=0.999 8）大于直線回歸的（R2=0.999 7），因此選擇曲線法求出的各土樣待測液的酚濃度進行計算，以表征土壤磷酸酶活性。

3 討論與結論

土壤酶活性的測定與土壤常規分析略有不同，在土壤酶活性測定實驗中，除了需設置試劑空白，每個土樣還需設置無基質對照，若測定方法中顯色劑本身是有顏色的（如本法土壤磷酸酶的測定），測試中建議以蒸餾水為參比溶液調節儀器零點，測出加基質樣品、無土對照及試劑空白測試液的吸收值，再依據回歸方程擬合求出其酚濃度；另外在測試未知土壤的磷酸酶活性時，若配制了濃度范圍較寬的標準系列溶液，其最高濃度標準溶液的吸收值較高時，如本試驗最高濃度標準溶液的吸收值接近0.9，建議以一元二次回歸方程擬合求解樣品測試液的酚濃度。

本實驗以蒸餾水為參比溶液調節儀器零點的好處在于：對于顯色劑本身是有顏色的情況下，能夠測知標準空白測試液及無土對照測試液（即試劑空白）的吸收值高低；當空白測試液的吸收值過大時，結果計算時就不能采用扣除空白值的校正方法，而應當純化試劑、提高蒸餾水質量等方法改進；若直接以標準空白或試劑空白為參比溶液調節儀器零點，雖可消除顯色試劑中的待測組分產生吸收的影響，但很難發現試劑空白值的大小。

對于土壤磷酸酶活性測定方法中易揮發溶劑配制的帶有顏色的顯色劑，必須十分嚴格控制顯色劑的加入量，使用加液路徑相對較密閉的活塞式定量加液器，同時適當降低顯色劑的配制濃度以擴大加入量，減小因量小濃度高而造成的誤差，提高樣品分析的精密度和準確度。

參考文獻

[1] A.F.Harrison. 土壤有機磷——文獻述評[J]. 土壤學進展，1990，18（4）：11-19.

[2] 沈桂琴. 土壤中磷酸酶活性的測定方法[J]. 土壤肥料，1987（3）：40-42.

[3] 趙蘭坡，姜 巖. 土壤磷酸酶活性測定方法的探討[J]. 土壤通報，1986（3）：138-141.

[4] 夏 棟，許文年，趙自超，等. 土壤磷酸酶測定中不同緩沖溶液對顯色液吸收波長的影響[J]. 湖北農業科學，2012，51（5）：997-999.

[5] 關松蔭. 土壤酶及其研究方法[M]. 北京：農業出版社，1986：272，309-312.

[6] 葉憲曾，張新祥. 儀器分析教程[M]. 北京：北京大學出版社，2009：37.

[7] 黃一石，吳朝華，楊小林. 儀器分析[M]. 北京：華學工業出版社，2008：70.

[8] 中國土壤學會. 土壤農業化學分析方法[M]. 北京：中國農業科技出版社，1999：614-616.

[9] 周聰韌. 制作標準曲線中存在的問題及修正方法[J]. 西北農業大學學報，1993，21（2）：104-106.

[10] 劉東梅. 用分光光法繪制標準曲線時應注意的問題[J]. 甘肅環境研究與監測，1996，9（4）： 48-51.