淺談2014年諾貝爾化學獎:超高分辨率熒光顯微成像*

孫育杰 陳軒澤

(北京大學生物膜與膜工程國家重點實驗室 生命科學學院生物動態光學成像中心 北京100871)

1 光學顯微成像的衍射極限

生物醫學成像技術是基礎生物學研究和臨床醫學最重要的工具之一。回顧歷史，已有多位科學家憑借在成像技術方面的突破獲得諾貝爾獎。其中，Roentgen因發現X射線獲得1901年諾貝爾物理學獎;Zernike因發明相襯顯微鏡獲得1953年諾貝爾物理學獎;Ruska的電子顯微鏡以及Binning和Rohrer的掃描隧道顯微鏡獲得1986年諾貝爾物理學獎;Lauterbur和Mansfield因發明核磁共振成像技術共同獲得2003年諾貝爾生理醫學獎。在剛剛過去的2014年，諾貝爾獎評審委員會再一次肯定成像技術的重要性，將諾貝爾化學獎授予發展超分辨率熒光顯微成像技術的3位科學家。他們分別是來自美國霍華德·休斯醫學研究所的Eric Betzig、德國馬普生物物理化學所的Stefan W.Hell和美國斯坦福大學的William E.Moerner(圖1)。

圖1 獲得2014年諾貝爾化學獎的3位科學家

光學顯微成像的起源大約可以追溯到16世紀末荷蘭眼鏡商Janssen和他的兒子發明的原始光學顯微鏡。他們把兩個凸透鏡安裝在一個筒中，發現這種組合可以放大物體。在之后的幾十年中，荷蘭人Anthony Von Leeuwenhoek和英國人Robert Hooke在成像原理和實踐中不斷改進，實現了現代光學顯微鏡的雛形。Leeuwenhoek第一次觀察到了牙縫中的細菌;而Hooke則于1665年在顯微鏡下看到了軟木塞的微小結構并將其命名為細胞(cell)，成為生物學研究的一個里程碑。在接下來的300多年里，各種基于光學顯微的生物成像技術不斷涌現，生物學家也因此取得了一個接一個重大發現。

雖然光學顯微鏡如此有用，但生物學家一直不滿意其分辨率。特別是細胞生物學家在觀察細胞內部結構時圖像模糊，無法看清楚細節。在實際操作中，有多種因素會影響光學成像的清晰度，包括樣品自身的背景光以及對光的吸收、散射和折射等光與物質的相互作用過程，也包括物鏡的色差、球差、透光度和成像元件的靈敏度等硬件因素。在這些因素之外，光學成像的分辨率的理論極限則是由光的衍射決定的。早在1835年，英國科學家George B.Airy就提出了“愛里斑(Airy disk)”的概念(圖2):由于光的衍射，即使一個無限小的發光點在通過透鏡成像時都會形成一個彌散的圖案，即愛里斑，而其在像平面處的光強分布函數稱為這個光學系統的點擴散函數(point spread function，PSF)。

圖2 George B.Airy和他提出的愛里斑

1873年，德國著名科學家Ernst Abbe揭示了由于光學成像有限孔徑下光的衍射效應產生的Airy disk與成像分辨率之間的關系，即著名的阿貝光學衍射極限理論(Abbe's diffraction limit)［1］。

式中d是分辨率，λ是光的波長，n是介質的折射率，θ是聚焦光錐的半角。nsinθ又稱為數值孔徑(numerical aperture，NA)。基于這個公式可以看出，對于可見光波段(波長400～700nm)以水為介質的成像，由于水的折射率為1.33，而sinθ最大值是1，則其分辨率極限約為150nm。當然，θ角無法達到90度，而實際上水鏡的數值孔徑(NA)一般在1左右。所以通常可以定義成像分辨率約為光的波長的一半，即當兩個點光源相距200nm以內時，它們的Airy disk會有很大的重疊而無法區分;同時這個公式也限定了光束聚焦形成光斑的最小尺寸約為光波長的一半。阿貝光學衍射極限理論給了我們基本的物理極限，意義重大，因此Abbe的這個經典公式也成為了他墓碑上的全部內容(圖3)。

圖3 Ernst Abbe揭示了光學成像中著名的阿貝光學衍射極限理論(Abbe's diffraction limit)，其經典公式成為他墓碑上的全部內容

關于阿貝光學衍射極限還有兩點值得一提。一是該衍射極限對分辨率的限制也適用于其他基于物質波成像的技術，從X射線到超聲成像。像X射線和電子顯微鏡的成像波長遠遠小于可見光的波長，因此有非常高的空間分辨率。但可惜這兩個技術目前在活體成像方面還有很多困難，另外也不容易像熒光顯微鏡一樣對目的分子實現特異成像和觀察。另外一點是這個200nm的分辨率極限正好對生物學研究有很大的制約。首先，很多亞細胞結構和細胞器的尺度都是幾百納米到幾微米，而最常用的模式生物之一大腸桿菌也就是2微米長、0.5微米粗。在這些情況下，200nm的分辨率極限制約了我們對于細節的觀察。另外，細胞本身是高度擁擠的，即使目的分子的細胞內濃度只有1μmol/L，在光學衍射極限的200nm見方的立方體中也有5個目的分子，而衍射極限的存在卻使我們無從知道這個體積內的具體分子數目，也無法區分它們。因此，生物學研究迫切地需要“突破”衍射極限的超高分辨率顯微成像技術。

2 “突破”光學顯微成像的衍射極限

實際上，衍射極限是一種遠場(far-field)效應，在近場(near-field)條件下無效。因此早期的一些嘗試突破光學衍射極限的努力都是基于近場光學成像的。像這次諾貝爾獎得主Eric Betzig就早在1993年發展了掃描近場光學顯微鏡，首次實現了室溫下的單分子超分辨率成像［2］。然而，近場光學顯微鏡無法用于細胞內部的成像，因此在生物領域的應用一直沒有發展起來。后期的各種“突破”光學衍射極限的努力都是在遠場條件下發展起來的。

超高分辨率顯微成像一般指在遠場條件下基于熒光的、“突破”衍射極限的光學顯微成像技術。熒光是物質吸收光照后發出的一類光。物質分子中的電子分布在不同的能級上。當一束光打到分子，分子具有一定的概率吸收光子，同時其處在基態的電子會躍遷到更高能量的激發態能級。處在激發態的電子有多種途徑回到基態，其中一條途徑就是發出一個光子(熒光)，釋放能量回到基態。發射光子的能量小于被吸收的光子，因此熒光的波長比激發光的波長要長。熒光顯微鏡利用了熒光發射光波長比吸收光波長較長這一重要原理，通過光路設計，分開激發光和發射光，大幅降低了成像的背景。結合靈敏的檢測器件，在優化條件下，熒光顯微鏡還可以檢測單個熒光分子發出的極其微弱的熒光，成為單分子成像的最佳選擇，其發展也奠定了這次諾貝爾化學獎的半壁江山。除了低背景和高靈敏度，熒光顯微鏡還通過對特定分子進行標記，具備很高的特異性。這一系列特點使得熒光顯微鏡成為生物學研究中最常用的一種光學顯微鏡。

超高分辨率熒光顯微技術通過應用一系列物理原理、化學機制和算法“突破”了光學衍射極限，把光學顯微鏡的分辨率提高了幾十倍，使我們能以前所未有的視角觀察生物微觀世界。目前的超高分辨率熒光顯微技術大體可分為兩類，一類通過調制照明光斑縮小系統的點擴散函數來實現超分辨成像，主要貢獻者包括這次諾貝爾獎得主Stefan Hell以及Mats Gustafsson;另一類則是基于單分子定位的超分辨技術，主要貢獻者包括這次諾貝爾獎得主Eric Betzig、W.E.Moerner以及哈佛大學莊小威教授和Samuel Hess。

2.1 基于點擴散函數調制的超分辨技術

此次獲獎的德國科學家Stefan Hell現為德國哥廷根大學教授和德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長。他在1994年還在做博士后的時候就最先提出了受激發射損耗的方法(stimulated emission depletion，簡稱STED)來打破光學衍射極限［3］。其原理非常樸素但卻十分巧妙。前面提到由于衍射極限的存在，光束聚焦的光斑尺寸不能無窮小，而是限定為光的波長的一半，這對應了熒光顯微鏡中聚焦激光光斑的點擴散函數。理論上，如果能縮小激光光斑就可以實現超分辨成像。Hell的基本想法是在激發光斑點擴散函數周圍套上一個環形點擴散函數，以“擦除”激發光斑的外圍，從而使得激發光斑“變小”(圖4)。在這里，Hell利用了產生激光的受激輻射原理，用位相板產生環狀的激光光斑并套在激發光斑外。這個環狀光的波長匹配激發態到基態的能量差，同時功率夠高，使得其區域內處在激發態的熒光分子在環狀光照射下會發生整齊劃一的飽和受激輻射。因為受激輻射波長與自發輻射(熒光)不同，所以環狀光覆蓋的受激輻射可以被擋住，而環內的自發輻射則是我們需要的熒光。由于環狀光的孔徑理論上可以通過增加激光強度無限縮小，這樣就可以獲得一個小于衍射極限的熒光激發點。這樣，Hell的方法就更改了Abbe的衍射極限公式:

式中Ⅰs是飽和受激輻射的激光強度，Ⅰ是環狀光的強度。可見，隨著Ⅰ的增加，STED技術的分辨率可以無窮小。

圖4 德國科學家Stefan Hell發明的受激發射損耗的方法

這個巧妙的思想在技術實現上當時是非常困難的。Hell經過多年堅韌的努力，終于在2000年實現了他在1994年提出的這個想法［4］。他用一束激光激發熒光分子發光，再用另一束環狀激光消除激發光周邊的熒光，通過二維點掃描實現了超高分辨率成像，將光學顯微鏡分辨率提高了近10倍。然而由于熒光分子一般飽和光強較高，可達100MW/cm2，因此環狀光需要極高的功率，大大加重了樣品的光損傷和光漂白，制約了STED技術在生物中的應用。從2000年開始，Hell的團隊不斷改進STED技術，包括通過相似原理發明了基態損耗(ground state depletion，GSD)［5］等一系列超高分辨率顯微技術，使其更加適用于生物研究。后期，Hell團隊將STED的思想進一步延展，將這種利用飽和激發壓縮激發光點擴散函數并驅動熒光分子熒光態(亮態)和非熒光態(暗態)之間的轉化的方法統稱為可逆飽和線性熒光躍遷(reversible saturable optical linear fluorescence transitions，簡稱RESOLFT)，其分辨率統一由式(2)描述［6］。值得一提的是，Hell早期發明的STED和GSD等技術是基于熒光分子電子能級的躍遷，這些狀態的躍遷及弛豫速率都非常快，因此需要很高的飽和光強來實現飽和受激輻射。為了進一步提高RESOLFT技術的生物兼容性，Hell團隊利用熒光分子的可逆構像變化等化學過程對應的可逆光開關(reversible photoswitch)來實現超高分辨率成像。基于分子化學過程的亮態和暗態間的轉化所需的飽和光強很小，大大降低了光損傷和光漂白。這類方法的不足之處在于其每個點的成像時間較長，所以通過點掃描成像將耗費太多時間。為此，Hell團隊在2013年發明了一種平行RESOLFT方法(parallelized RESOLFT approach)，將十萬個STED光斑排成一個矩陣來成像，用rsEGFP熒光蛋白在活細胞內實現了約1s時間分辨率的超高分辨率成像［7］。Stefan Hell 20年來的一系列工作為超分辨率熒光顯微成像技術的發展做出了巨大貢獻。

在這個方面值得一書的還有美國科學家Mats Gustafsson，他是光學成像領域公認的天才。Gustafsson在2000年發明了基于結構照明原理的超高分辨率技術［8］。這個技術基于兩個高空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過解析低頻莫爾條紋實現超高分辨率成像(圖5)。這個技術使用起來非常簡單，對樣品制備也沒有任何特殊要求，因此非常適于細胞研究，但可惜分辨率只能提高一倍。在此基礎上，Gustafsson在2005年發明了飽和SIM，與RESOLFT原理相似，利用熒光飽和實現更高的分辨率，其本質也是點擴散函數的縮小［9］。可惜Gustafsson于2011年51歲時因癌癥英年早逝，無緣分享這次的諾貝爾獎。

圖5 美國科學家Mats Gustafsson基于莫爾條紋原理發明的結構照明超高分辨率技術

2.2 基于單分子定位的超分辨技術

另一大類超分辨熒光顯微成像技術的發明是基于單個熒光分子的定位。雖然Abbe衍射極限指出無法區分相距約200nm的兩個熒光分子，但是通過提取單個熒光分子的愛里斑信息卻可以實現對這個熒光分子的精確定位。對單個熒光分子的成像嘗試最早可以追溯到1976年，T.Hirschfeld使用基于全內反射式的近場照明方式實現了對單個蛋白抗體分子的熒光觀察。但他當時在抗體上標記了數十個熒光基團，因此并非對單個熒光分子的成像［10］。這次獲獎的美國斯坦福大學教授W.E.Moerner是單分子熒光技術的先驅人物。他于1989年在超低溫下首次實現了單個分子的吸收光譜測量［11］。這一開創性研究直接激發了后續的一系列單分子熒光方面的突破性工作。1990年，M.Orrit在低溫下實現了對單個熒光分子的熒光測量［12］;同年，R.A.Keller等人則利用共聚焦顯微鏡和脈沖激發等方法在室溫下實現了對溶液中單個熒光分子的檢測［13-14］。此次諾貝爾獎得主Eric Betzig則在1993年利用近場顯微鏡首次實現了常溫下單個熒光分子在表面的成像［2］。1994年，R.A.Keller［15］，S.Xie［16］以及S.Nie，D.Chiu和R.Zare等人［17］在單分子檢測方面接連取得突破;而在1995年，日本Yanagida團隊使用全內反射顯微鏡觀察到了熒光標記的ATP分子和單個肌球馬達蛋白分子的相互作用，開創了單分子技術在生物系統中的應用［18］。利用單分子定位研究生物學問題最有影響力的一個工作是2003年Yildiz等人使用全內反射單分子熒光顯微鏡追蹤Cy3熒光標記的單個肌球馬達蛋白分子沿著肌動蛋白微絲的行走。在這個工作中，單個肌球蛋白分子的位置被精確定位，精度達幾納米，因此可以觀察到肌球馬達蛋白分子約37納米的步長，并推斷出其行走方式是像人一樣兩個腿交替邁進［19］。這一高精度單分子熒光定位方法被稱為fluorescence imaging with 1-nm accuracy，簡稱FIONA。其原理是基于2002年Webb等人的工作［20］。他們指出，單個熒光分子的愛里斑雖然有幾百納米寬，但其光強度的分布卻像山峰一樣，峰尖對應熒光分子的位置。這個類似于山峰的光子分布可以用一個二維高斯函數來擬合，其中心即為熒光分子的物理位置，而定位中心的誤差則由下式給出:

式中σμi代表中心位置μ在x和y方向上的定位誤差，i指代x和y方向;Si為高斯擬合在x和y方向上的標準偏差;N為檢測到的光子數;a是探測器有效像素尺寸;而b為背景噪音。如果忽略像素尺寸和背景噪音的影響，可以看出單分子的定位精度與光子數的平方根成反比。與式(1)結合，則基于單分子定位的理論成像分辨率為:

在通常情況下，一個熒光蛋白分子可檢測到的光子數約為幾百個，而一個熒光染料分子為幾千個。通過擬合找到峰尖，精確度高達幾納米，遠超衍射極限。因此通過單分子定位的原理可以將熒光成像的分辨率提高幾十倍。即便如此，還需要同時考慮的是解析一個結構時的分辨率也是由采樣密度(頻率)決定的，即所謂Nyquist-Shannon采樣定律。該定律指出，為了解析一個空間頻率為f的信號，檢測的空間采樣頻率至少應為2f。換句話說，在超分辨熒光顯微鏡成像中，樣品的標記密度至少應為空間分辨率的2倍［21］，如式(5)所示:

式中dsampling為由采樣頻率決定的空間分辨率，ρ為熒光標記密度，dim為空間維度。因此，單分子定位的有效空間分辨率為:

式(4)的分辨率是基于每個衍射極限體積內只有一個熒光分子，如果有兩個分子并且同時發光則還是無法分辨，也無法實現單分子定位。這就要求樣品的標記密度很低，然而這樣會導致式(5)中的采樣分辨率大大下降。

可見，將單分子顯微技術的高精度定位轉化為高分辨率的關鍵在于如何在一個衍射極限體積中區分多個熒光分子。最早在概念上提出解決方案的是此次諾貝爾獎得主Eric Betzig，他在發表于1995年的一篇文章中指出可以通過光譜來區分密集堆積的熒光分子并重構出一幅超高分辨率圖像［22］。由于可用的熒光分子種類及其光譜有限，且標記方法繁瑣，該方法的實現相當困難。盡管如此，這篇文章為之后的一系列工作打開了思路，使人們意識到可以利用熒光分子的各種過程和性質來實現超高分辨率成像，其中包括熒光分子的光漂白、閃爍、結合-解離、以及光控轉化等。在1997年，W.E.Moerner與憑借綠色熒光蛋白獲得2008年諾貝爾化學獎的R.Tsien合作發現了綠色熒光蛋白GFP的光轉化效應［23］。他們發現GFP在488nm的光照下發生閃爍并進入暗態。令人吃驚的是，這個暗態并非光漂白狀態，而是可以被405nm的激光激活并在488nm激光激發下重新發熒光。這是第一次發現可以用光來控制一個熒光分子的發光狀態，為基于單分子定位的超分辨技術打開了一扇大門。可惜的是，這扇已經開啟的大門并未受到過多關注，直到2002年J.Lippincott-Swartz等人對GFP進行改造取得了性質非常好的光激活熒光蛋白［24］。此時，Eric Betzig剛剛從工業界返回到學術界，他意識到這種光控熒光蛋白可以很容易地實現他在約10年前提出的想法。首先通過融合蛋白實現對樣品的高密度熒光標記，之后通過控制激光強度，使用非常微弱的405nm激光激活很少數目的熒光蛋白。因為這個激活過程是隨機的，所以激活的熒光蛋白分布稀疏而離散，就可以通過式(3)進行精確的單分子定位。當之前激活的熒光蛋白被488nm激光漂白后，405nm激光將會激活另一批熒光蛋白進行單分子定位。如此多次反復，就可以將高密度的熒光分子一一定位，同時滿足單分子高精度定位和Nyquist-Shannon采樣定律，把多張圖片疊加形成一幅超高分辨率圖像(圖6)。意識到這一點后，Betzig開始和Lippincott-Schwarz及H.F.Hess合作以實現他的想法。

圖6 基于單分子定位的超高分辨率成像技術

2006年是超高分辨率熒光顯微技術發展的重要一年。在這一年，Betzig和Lippincott-Schwarz以及H.F.Hess合作發明了基于熒光蛋白單分子定位原理的PALM(photoactivated localization microscopy)技術［25］;幾乎在同時，哈佛大學莊小威研究組發表了基于熒光染料單分子定位的STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)技術［26］;隨后，Samuel Hess研究組也獨立發明了FPALM(fluorescence photoactivated localization microscopy)技術［27］。它們在原理上都是基于熒光分子的光轉化能力和單分子定位(圖6)。這種“以時間換空間”的思路非常巧妙，把熒光成像的分辨率一下子提高了20倍左右。加之這些技術實現比較容易，因此大大推動了超分辨熒光顯微鏡技術的成熟和在生物學研究中的廣泛應用。莊小威教授本科畢業于中科大少年班，34歲獲得哈佛大學的正教授職位，40歲當選美國科學院院士。作為STORM技術的發明人，莊小威教授一直領導并推進著超高分辨率顯微技術的發展和應用，包括在率先實現單分子超分辨技術的先后實現了多色、三維和活細胞高速成像以及在各種生物問題中的應用;她領導的團隊是近8年來這個領域最活躍的研究團隊。

除了STORM/(F)PALM技術，還有幾種基于單分子定位或熒光分子閃爍的超高分辨率熒光顯微技術，包括PAINT(points accumulation for imaging in nanoscale topography)［28］，SOFI(super-resolution optical fluctuation imaging)［29］和3B(bayesian analysis of bleaching and blinking)［30］。這些技術的出現進一步豐富了超分辨技術的選擇和應用范圍。

3 總結與展望

超高分辨率熒光顯微成像作為一類很新的技術，突破了光學成像中的衍射極限，把傳統成像分辨率提高了10～20倍，達到了幾十納米，把我們從顯“微”鏡時代帶入到顯“納”鏡時代。對生物學家而言，好比一個近視眼的人突然戴上了合適的眼鏡，從而可以用前所未有的視角觀察奇妙的生物微觀世界，揭示前所未見的生物微觀結構和現象。這些超分辨技術在過去的七八年間不斷進步，同時也已經在生物學研究中廣泛應用，包括細胞膜蛋白分布、細胞骨架、線粒體、染色質、神經元突觸以及原核生物的研究等。超高分辨率技術一出現就引起廣泛關注，先是在2006年被世界著名期刊Science評為年度10大技術突破，接著被生物醫學方法學最好的期刊Nature Methods評為2008年年度方法。在2014年10月的Nature Methods10周年特刊評出的10年10大技術中，超高分辨率熒光顯微成像和單分子技術都出現在榜中，并幾乎在同時獲得2014年諾貝爾化學獎。

展望未來，超高分辨率顯微技術的發展趨勢應該是更高、更快、更深(即更高的空間分辨率、更快的時間分辨率以及更深的成像深度)，這與生物醫學成像越來越多地應用于活體研究的趨勢需求是一致的。與這些趨勢相對應并值得關注的幾個方面可以大致歸納如下。

首先是通過進一步的物理成像、化學修飾原理創新，發展新型的超分辨技術和標記技術。目前的各種超分辨技術時間分辨率都不夠，成像深度更是不能滿足在體成像的需求。其中，提高超分辨技術時間分辨率，需要結合新型成像器件，例如更快的掃描元件，更靈敏的檢測元件等;實現更深的成像深度和解決在體成像需求，還需考慮到組織對光子的散射作用，結合自適應光學和組織透明化(CLARITY)技術是解決這一問題的關鍵之一。

第二是進一步發展和優化熒光探針，比如提高探針的亮度、光穩定性、轉換速率以及發射波長等。為解決現有探針的信噪比差、光漂白嚴重等缺陷，開發新型高亮度、高穩定的熒光探針成為推動超分辨技術的保證。例如上轉換納米材料，熒光鉆石，石墨烯量子點等無機染料。此外，結合現有探針和超分辨技術，發展新型超分辨標記技術，如聯合標記、特異性活細胞標記染料、量子點等。

第三是注重模態融合。生命體組成跨越了很大的空間尺度，而不同尺度下的生命功能、結構和過程都緊密聯系和互相影響。沒有哪種技術能兼顧時間分辨率、空間分辨率、空間尺度和功能成像，因此多模態融合是一個必然趨勢。對于超分辨技術而言，至少有3種值得融合的技術，并且都已經出現了一些研究成果。一種是與雙光子熒光顯微鏡結合，雙光子熒光顯微鏡基于非線性效應，具有成像深度深、熒光背景低的優點;一種是與電子顯微鏡結合，即光電融合顯微技術CLEM(correlative light＆electron microscope)。CLEM結合了電鏡的高分辨率和光學顯微鏡的分子特異性，是研究結構和功能關系的利器，因此成為目前國際上顯微成像技術的研究熱點和重要發展方向。中科院生物物理所徐濤研究員在基金委重大儀器專項的支持下，從2011年已展開光電融合顯微技術的研發并且取得了世界領先的成果。再一種是與片層光結合。片層光顯微成像技術是一個古老卻又重新煥發生機的成像技術，其片層光照明方式一方面大大降低背景熒光信號，一方面比常規雙光子、共聚焦顯微鏡有更高的時間分辨率，具有光毒性小、信噪比高、成像速度快等一系列優點，是研究小模式生物的利器，也因此被評為Nature Methods的2014年年度方法。在基金委重大儀器專項支持下，北京大學陳良怡和孫育杰研究組合作，于近期發明了目前世界上性能最卓越的雙光子層狀光顯微鏡并已展開相關應用［31］，而與超分辨技術的結合將會成為在體超分辨成像的重要工具。

第四則是注重發展數據處理和圖像分析算法，迎接大數據時代的到來。隨著信息技術的發展，大數據時代翩然而至，生物醫學成像也不例外。一方面，對活體動態觀察的需求導致了大數據影像資料;另一方面，對于樣品三維高分辨率成像的需求也導致大數據。面對海量數據，我們需要發展更加高效的圖像處理軟件和算法，這將是未來超高分辨率動態成像的一個重要挑戰。

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