金屬硫蛋白的檢測方法研究進展

劉璐，劉慧萍，陳伶利，劉俐，向琴，李玲，朱應武

(湖南中醫藥大學 中醫學院，湖南 長沙 410208)

金屬硫蛋白(MTs)，是廣泛存在于生物體中，具有低分子質量(1 ～10 kD)、富含半胱氨酸(20% ～30%)、缺乏芳香族氨基酸的一類金屬結合蛋白質［1-4］。1957 年，Margoshoes 等［5］首次報道從馬腎中分離得到Cd-MT，此后，MTs 便成為基礎和應用科學研究的熱點之一，研究內容涉及生物體微量元素的儲存、運輸和代謝，重金屬的解毒、清除自由基和參與應激反應等生物學功能的關系還有與疾病的關系等各方面。近年來，人們對其進行了廣泛而深入的研究，生物化學領域國際權威叢書都已開辟了金屬硫蛋白這一專欄。目前，MTs 在生物學領域、醫學保健領域、轉基因工程領域、環境檢測標志物和疾病防治等應用的研究顯示了誘人的前景。因此，盡快尋找一種能準確、快速的檢測金屬硫蛋白的方法，從而更加深入的對其進行研究，使其能夠發揮更大的作用顯得十分必要。迄今為止許多研究者先后應用和發展了關于檢測MTs 的技術，主要有金屬結合法、電化學分析法、蛋白質分析法、色譜、光譜分析法等。本文重點闡述目前對MTs 檢測方法的研究進展。

1 金屬結合法

金屬結合法是利用MTs 對金屬具有高親合力的特點，通過其對不同金屬親合力的差異性以及其熱穩定性而建立的檢測方法。要計算MTs 的含量，關鍵是通過測定與MTs 結合的金屬及競爭性替換金屬的含量來檢測MTs。

1973 年，Piotrowski 等［6］基于Hg2+在酸性環境下與MTs 結合的原理，首先創建了測定組織中MTs的金屬結合法。該法迅速而簡便，但存在一些缺點，如在酸性環境下可與MTs 結合，并且還可將其他金屬離子置換出來。同時此法對于203Hg 加入的用量極為苛刻，加入量過小將導致測定的結果偏低;加入量過大將可能會出現測定結果偏高。所以操作起來難以掌握，鑒于此，有專家利用層析技術改良原來方法后可檢測出100 μL 中100 nmol 的MTs。緊接著相繼出現Cd/血紅蛋白親和分析法、銀血紅蛋白飽和法和銀染法等。

Cd/血紅蛋白親和分析法［7］是一種快速、靈敏、特異的評估生物樣本中MTs 含量的方法，本方法的優點是能夠評估大多數生物組織中MTs 含量，具有快速、周期短、靈敏、消耗少、適于大量研究，缺點是還存有潛在誤差，無法用于血漿或全血MTs 檢測。1995 年戴建國等用鎘飽和法測定小白鼠肝中金屬硫蛋白，該法通過口給以鋅鹽誘導小鼠金屬硫蛋白合成，利用鎘飽和法進行研究，該方法有較好的重現性。林芃等［8］于2001 年用血紅蛋白/鎘飽和法測定魚組織中的MTs，此法測定魚組織中的MTs 濃度具有快速、靈敏、耗時少、有利于大量研究等特點。本方法能檢測40 ng MTs(組織濃度0.18 μg MTs/g)，重復分析的RSD ＜均值的4%。2012 年黃偉等用血紅蛋白/鎘飽和法測定大鼠肝和血中MTs。

銀血紅蛋白飽和法［9］主要基于Ag+與MTs 巰基團高度親和性的特征測定組織中MTs。銀飽和法可以檢測出的MTs 來源范圍很廣。而且，體外研究證明1 mol 金屬硫蛋白能結合17 g 原子Ag，卻只能結合7 g 原子Cd。所以，Ag 飽和法可能比Cd 飽和法有更高靈敏性，也可以認為銀飽和法測定MTs 要優于Cd 飽和法。所以當測量低濃度MTs 時，Ag 飽和法為優先選擇。張保林等［10］基于Ag+與MTs 的高親合力，及MTs 具有熱穩定性的特點通過原子吸收光譜(AAS)測定了兔肝Zn-MT。該方法測定MTs濃度不需要去除樣品中共存的其它蛋白質，操作方便、重復性和準確性好且不需特殊的儀器設備。檢測下限為1 μg/mL。

Fuminor 等［11］用SDS-PAGE 后銀染確定MTs 的方法來檢測鎘中毒小鼠的肝臟和其它來自體外培養細胞的提取物中MTs。本方法通過優化條件，使最低檢測限為ng/lane。

金屬結合法是通過檢測金屬的含量從而間接的推算得到MTs 的含量，因此其特異性不如直接檢測的高。如:Hg 飽和法中Hg+不僅能與MTs 相結合也會結合其它一些小分子量化合物;Cd 置換不出已與MTs 結合的Ag 或Cu 等。

2 電化學法

電化學方法是通過測定巰基(—SH)然后計算出MTs 的濃度。巰基的測定是利用其在汞滴電極表面產生氧化還原反應出現的電位變化來實現。

因為金屬結合法具有特異性較差的缺點，因此在1979 年Olafson 等［12］建立了不受分子中金屬含量影響的方法，此法使用示差脈沖極譜法測定MTs其檢出下限是10－8mol/L。該法的優點是能夠特異地反映出MTs 的量而不是金屬的量，但缺陷是容易受樣品中具有還原性物質的干擾。

Bordin 等能快捷地分析出還原型的MTs 并利用示差脈沖極譜法可以非常方便地檢測出樣品中多種形式的MTs，本方法通過改變檢測體系中的pH值而達到目的。

Bebianno［13］于1992 年 檢 測 了 貽 貝 組 織 中 的MTs 的含量，應用差分微分脈沖極譜法測定。鐵峰等［14］應用線掃極譜法快速測定魚組織中的金屬硫蛋白。此法分離方法比傳統方法簡單省時，適合實驗室規模分離純化。褚德瑩等利用線伏安法通過測定生物組織中金屬硫蛋白的巰基在鈷氨溶液中的催化氫波測定金屬硫蛋白的含量。2001 年，李明春等［15］在酵母菌類金屬硫蛋白的分離純化及性質鑒定中采用組織化學的方法，使用DTNB 檢測巰基濃度。2003 年，Hourch 等在采用雙波陰極溶出伏銨法測定了MTs 其檢測下限為6 ×10－12mol/L。本方法靈敏度高，用于組織和體液中MTs 的測定。2006年，Nunez 等采用示差脈沖極譜法對水生物體中MTs 的測定。檢測范圍為0 ～25 mg/g dw。2008年，Almroth 等采用示差脈沖極譜法測定MTs，其檢測范圍為1 ～10 mg/g pr。

3 蛋白質分析法(免疫法)

蛋白質分析法(免疫法)通過蛋白質含量測定來計算MTs 濃度，免疫法具有靈敏(靈敏度在pg/mL級)、特異等特點，因此適用于微量檢測。近年來建立了放射免疫分析法(RIA)、競爭性酶聯免疫吸附分析法(CELISA)和酶聯免疫吸附分析法(ELISA)等用于MTs 的檢測。

1979 年，Mallie 等最先建立檢測了大鼠血清中的MTs 濃度的方法是利用RIA 技術，此方法檢測范圍為0.1 ～100 ng/mL。1990 年，Mulder 等建立應用RIA 技術檢測人體液MTs 濃度的方法，本方法因抗體來源和特性不同將導致結果不同，具有高度特異性。但本方法使用了放射性同位素，具有放射性污染且需要使用昂貴的專用儀器測量。1986 年，Thomas 等首先建立了快速、不需要接觸放射性同位素且靈敏度可達100 pg/mL 的酶聯免疫吸附分析法測定MTs 含量，此法結果與放射免疫分析法相似，但比放射免疫分析法相對迅速、成本低和安全。

1995 年，Akintola 等［16］通過酶聯免疫吸附分析法測定人血漿和尿液中MTs 濃度，此方法的靈敏度為5.0 ng/mL。Van 等［17］建立的ELISA 可檢測出60 pg 的人胎肝的MTs，并且發現抗體的特異性與MTs 所含的金屬離子種類有關系。還有學者［18］建立ELISA 來檢測不同亞型的MTs 是通過合成某一段特異的肽鏈，或者免疫動物制備表位特異性抗體。Margarita 等［19］開發出以辣根過氧化物酶(HRPO)標記的MTs 作為共軛物和兔IgG 的高滴度多克隆抗體檢測人血清中MTs 含量的一種新的靈敏的競爭性ELISA 系統。該系統可以有效測定MTs 的范圍為10 ～2 000 000 pg/mL，檢測下限(0.5 pg/well)因此，此方法不僅能夠用于檢測生物材料中MTs 的濃度，而且還能夠研究MTs 含量的微小偏差。1999年，鄭軍恒等［20］建立了兩種酶聯免疫吸附分析法，并成功運用于血液MTs 濃度的測定。直接型酶聯免疫吸附分析法(檢測范圍1 ～10 ng)和競爭型酶聯免疫吸附分析法(檢測范圍50 ～500 ng)可分別運用于較純的樣品和較粗的樣品中MTs 的濃度的檢測。張亨山等［21］于1997 年建立利用單克隆抗體為二種能識別不同抗原決定簇的兔肝MT2的雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析法。本方法有較好的靈敏性(靈敏度為20. 0 ng/mL)和可靠性。且運用于人MTs 濃度的檢測。黃波等［22］于2000 年利用生物素-親和素系統建立的競爭型酶聯免疫吸附分析法，其系統提高了方法的靈敏度(檢測下限:2.5 ng/mL)并可用于檢測人體尿液中MTs 的含量。此方法操作內和操作間的變異系數分別為2.25%和1.19%，回收率為97.6% ～100.0%，說明此方法具有較好的精密度和準確度。2009 年，Meistertzheim 等建立了ELISA 方法測定牡蠣中MTs 含量，檢測范圍為0. 01 ～0. 5 mg/g。2010 年，賈連群等［23］改進了競爭型ELISA 檢測人尿MTs 含量的方法，通過分離純化成人肝臟金屬硫蛋白來制備抗金屬硫蛋白單克隆抗體。在應用中此方法有較好的精確度和準確度。

免疫檢測方法的不足之處為:其中有些方法存在交叉反應、需要接觸放射性同位素，操作不方便，還有學者［24］認為MTs 具有大量的二硫鍵，其特性容易被氧化，使其免疫性被改變，進而將影響蛋白質分析法的測定結果。

4 色譜、光譜分析法

Hunziker 等［25］利用原子吸收光譜法來測定樣品的金屬含量，從而檢測出MTs 的濃度。該法使用RPHPLC 從兔組織樣品中分離出的7 種亞型作為樣品。Suzuki 等可在1 h 內檢測出濃度＜1 μg/mL 的1 mL 上柱樣品中的MTs 含量，并可以測定不同型的MTs。本方法可以避免常規色譜層析法的分辨力差并且洗脫費時的缺陷。Jin 等［26］利用高效液相色譜法分離MTs，該法的靈敏度＜1 μg/mL，本方法直接對MTs 的定量檢測是基于樣品對紫外吸收的特性。2008 年，Jebali 等［27］通過Cu、Cd 和Hg 誘導肝臟中的MTs，利用RP-HPLC-FD 測定。該方法比用分光光度計檢測靈敏度高，特異性好。2013 年，薛金花等［2］通過左氧氟沙星-鈀作為熒光探針利用共振散射法檢測MTs 濃度并成功應用于人尿液中的檢測。2012 年，劉璐等［1，28］通過環丙沙星-銅配合物利用紫外分光光度法檢測MTs 濃度。第二年，他們團隊利用其配合物使用熒光分光光度法、共振散射法分別測定人尿液中MTs 濃度，并比較兩種方法。2014 年錢秋梅等［3］基于8-羥基喹啉-5-磺酸(HQS)-鎘配合物通過熒光猝滅法檢測尿液中MTs 濃度。檢出限為9.36 ×10－9mol/L。

以上所述的各種方法均具備各自的優缺點，對于組織器官中的MTs 的含量、體液中的MTs 含量(正常人血清和尿的MTs 含量一般不超過2 ng/mL和10 ng/mL)或MTs 含量較低的樣品、MTs 含量相對較高的樣品及MTs 的同分異構體則分別可利用HPLC-AAS 法和血紅蛋白飽和法、RIA 和ELISA 等免疫法、金屬結合法以及HPLC 法進行檢測。當然，檢測方法的測定結果還可能會受到如樣品處理方法、MTs 結合金屬的種類以及自身具有的廣泛性特點和生物作用多樣性特點等［29-30］因素的影響。總之，對于它的定量的方法仍然是多種多樣，并且這些方法還都存在著一定的缺陷，目前為止依然沒有找到一種定量檢測MTs 的統一標準方法［31］。近年來，隨著MTs 的深入研究發現其具有很大的開發潛力和無法估量的價值。將MTs 產業化成為必然，可目前卻存在相當大的問題，因為尚未發現一種簡便快捷、靈敏高且適用于產業化的綜合監測技術。因此，當前急需建立檢測MTs 的統一標準，而解決此問題也將會成為研究MTs 的重點攻關問題。

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