不同pH條件下五倍子中沒食子酸、單寧酸、β—PGG含量測定及分析

周國麗+鄭仕萍+楊曉紅郭雪+范源

摘要：目的 研究及分析在不同的pH溶液中，五倍子中沒食子酸、單寧酸、五沒食子酰基葡萄糖（β-PGG）的含量變化。方法 將五倍子粉末分別加入pH為4，4.5，5，5.5，6醋酸鹽緩沖液中，在95℃水浴條件下提取3.5 h，用反相高效液相色譜測定沒食子酸、單寧酸、β-PGG的含量。結果 當pH等于4時，五倍子醋酸鹽緩沖液的沒食子酸含量最高；pH等于4.5時，單寧酸的含量最高；pH等于5.5時，β-PGG的含量最高。結論 在pH分別等于4、4.5、5.5的條件下，五倍子醋酸鹽緩沖液中的沒食子酸、單寧酸、β-PGG的含量最高。

關鍵詞：五倍子；醋酸鹽緩沖液；β-PGG；沒食子酸；單寧酸；HPLC；不同pH

中圖分類號：P284 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2014）12-0059-03

五倍子是我國傳統中藥，《本草綱目》記載五倍子性酸、咸、平、無毒，能斂肺降火，化痰飲，止咳嗽、止渴等[1]。臨床研究表明五倍子具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒以及收斂等藥理作用。五倍子含有豐富的鞣質成分，如β-PGG、沒食子酸、單寧酸等，通常這些活性成分的提取方法有溶劑提取法[2-5]、水解法[6]等。為了研究五倍子提取的新實驗方法，通過用不同pH醋酸緩沖液，結合溶劑提取法提取五倍子中的β-PGG、沒食子酸、單寧酸，測定并分析其含量變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 干燥五倍子。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），醋酸（分析純），醋酸鈉，均購自云南丹赤貿易有限公司，純凈水。β-PGG標準品（購自成都普瑞法科技開發有限公司，批號：14021908）、沒食子酸（購自云南昆明中檢所，批號：110831-201204）、單寧酸標準品（成都邁斯克醫藥科技有限公司，批號：130721）。

1.2 儀器 DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機，D2KW-D電熱恒溫水浴鍋，Agilent1200型高效液相色譜儀（VWD檢測器），分析天平，酸度計（OHAUS/奧豪斯，型號 STARTER 3100/F）。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸、單寧酸、β-PGG對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸對照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入50%甲醇制成25 mg/mL的溶液，備用。精密稱取0.30 mg單寧酸對照品，用乙醇、水、丙酮體積比為69.9%、29.8%、0.3%的溶液溶解并定容，制備成濃度為30 ug/mL的單寧酸標準溶液，備用。精密稱定β-PGG對照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成25 ug/mL的溶液，備用。

1.3.2 β-PGG、沒食子酸、單寧酸供試品溶液的制備 干燥五倍子粉碎，過80目篩，備用。精密稱取5份五倍子粉末各約0.2 g分別置于250 mL帶塞錐形瓶中，分別精密加入醋酸鹽緩沖液40 mL，95℃水浴鍋中加熱水解3.5 h，冷卻，過濾。精密量取續濾液1.5 mL于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，均搖，即得供試品溶液。

1.3.3 沒食子酸含量測定方法

1.3.3.1 沒食子酸色譜條件 色譜柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（5∶ 95）為流動相；檢測波長為273 nm；柱溫：25℃。

1.3.3.2 沒食子酸線性關系考察 精密稱取對照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲備液。分別精密吸取0.1、0.5、1、2、4 mL于10 mL容量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制成濃度為1、5、10、20、40 ug/mL的標準溶液。按上述色譜條件進樣20 uL，以沒食子酸的峰面積（Y）對標準品的濃度（X）進線性回歸，得方程y=114.7x+2.4554，r=0.9999，結果表明：沒食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為1-10 ug/mL。

1.3.4 單寧酸含量測定方法

1.3.4.1 單寧酸色譜條件 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；以甲醇-水（80∶ 20）為流動相；檢測波長為275 nm；柱溫：25℃。

1.3.4.2 單寧酸線性關系考察 精密稱取對照品2.58 ug，置于10 mL容量瓶中，用乙醇、水、丙酮體積比為69.9、29.8、0.3%的溶液溶解并定容至刻度，搖勻作為儲備液。按上述單寧酸色譜條件分別取2、4、6、8、10 uL不同體積進樣，以單寧酸的峰面積（Y）對標準品的質量（X）進行線性回歸，得方程y=5719.5x-1924.8，r=0.9974，結果表明：單寧酸峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為0.516-2.58ug。

1.3.5 β-PGG含量測定方法

1.3.5.1 β-PGG色譜條件 色譜柱 C18柱（4.6×250 mm，5 um，Digma）；流動相：0 min：乙腈-0.1%磷酸（10∶ 90），15 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），15.1 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75），20 min：乙腈-0.1%磷酸（25∶ 75）；檢測波長為281 nm；柱溫：25℃。

1.3.5.2 β-PGG線性關系考察 精密稱取對照品8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，作為儲備液。從中精密吸取10 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述β-PGG色譜條件分別取2、4、6、8、10、15 uL不同體積進樣，以β-PGG的峰面積（Y）對標準品的質量（X）進行線性回歸，得方程y=2420237x-18.445，r=0.9998，結果表明：β-PGG峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為0.139-1.0428ug。endprint

2 結果與分析

2.1 實驗數據 見表1。

2.2 結果分析 用pH=4；4.5；5；5.5；6的醋酸緩沖液提取五倍子中的沒食子酸，含量最高的是pH為4的緩沖液，見圖1。單寧酸含量最高的是pH為4.5的緩沖液，見圖2。β-PGG含量最高的是pH等于5.5的緩沖液，見圖3。而pH為6時，五倍子中沒食子酸、β-PGG、單寧酸的含量均最低。

五倍子單寧酸是一種易水解的多酚化合物，其能在酸性、堿性條件下水解產生沒食子酸、β-PGG等中間產物，這些中間產物之間存在相互轉化的可能，導致在不同的pH條件下，單寧酸、沒食子酸、β-PGG的含量均呈現相應的變化。

3 結論

五倍子單寧酸的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法[7-10]、微波提取法[11-12]、加壓提取法[13]、超臨界CO2 萃取法[14]。沒食子酸的制備方法有酸水解法（常用硫酸）、堿水解法、發酵法、酶法。β-PGG的制備主要是醇解法[15-16]。本實驗運用HPLC法測定五倍子醋酸緩沖液在不同pH（4；4.5；5；5.5；6）條件下，其單寧酸、沒食子酸、β-PGG的含量變化，結果顯示pH等于4時，沒食子酸的含量最多。pH為5.5時，β-PGG的含量最多。pH為4.5時，單寧酸含量最高。而pH為6時，五倍子中沒食子酸、單寧酸、β-PGG的含量均最低，以上結果可能是沒食子酸、單寧酸、β-PGG在不同pH條件下穩定性及水解機制不同所致。

本實驗運用醋酸緩沖液提取五倍子中的有效成分，得出了提取沒食子酸、單寧酸、β-PGG的較適pH值，可為研究五倍子的制藥工藝、質量控制及五倍子開發利用提供一定參考。

參考文獻：

[1]吳力克.五倍子的藥理研究及臨床研究[J].中藥醫學刊，2001。19（1）：88-89.

[2]呂翔，楊子祥.角倍單寧酸和沒食子酸含量的比較及影響因子分析[J].林業科學研究，2010，23（6）：856-861.

[3]李紅然，付大友.五倍子中有效成分提取方法研究進展[J].工廣東化工，2010，37（10）：71，79.

[4]柳世萍，李毅.五倍子提取單寧酸的工藝研究[J].河北化工，2007，30（10）：44-45.

[5]帥益武，尤玉如，袁海娜.五倍子中鞣質的提取、分離純化研究[J].食品科技，2007，（6）：125-128.

[6]趙拉.五倍子制備沒食子酸的研究進展[J].化學與生物工程，2008，25（5）.

[7]張宗和，閔凡芹，秦清.超聲波輔助提取五倍子單寧酸的響應面優化實驗[J].生物質化學工程，2012，46（6）：12-16.

[8]姜寧，劉曉鵬.超聲輔助提取五倍子中單寧酸的研究[J].安徽農業科技，2007，35（27）：8675～8679.

[9]姜創，吳桐，劉海軍.超聲輔助法提取五倍子中單寧酸的工藝研究[J].食品與發酵科技，2009，45（2）：11-13.

[10]劉林，鄧自西.超聲波提取五倍子單寧酸的研究[J].精細化工中間體，2012，42（4）：58-60，65.

[11]姜寧，劉曉鵬，易先輝.微波輔助提取五倍子中單寧酸的研究[J].中國實用醫藥，2007，2（25）：81-83.

[12]秦清，閔凡芹，徐浩.響應面法優化微波輔助提取五倍子單寧工藝研究[J].林產化學與工業，2012，32（6）：84-88.

[13]申明樂.五倍子加壓提取單寧的工藝研究[J].山東化工，2007，36（12）：11-13.

[14]姜萍，黃娟，李春福.超臨界CO2萃取單寧酸的研究[J].林產化工通訊，2005，39（6）：17-19.

[15]YuminChen，Ann E.Characterization of Soluble Non-covalent Complexesbetween Bovine serum Albumin and β-1，2，3，4，6-penta-0-gall0yl-D-glucopyranose by MALDL-TOF MS[J].Agric.Food chem，2004，25，4008-4011.[16]Lili，AhmadAli Shaik，et al.Preparation of penta-O-galloyl--d-glucose from tannic acid and plasmapharmacokinetic analyses by liquidliquid extraction and reverse-phase HPLC[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54，545-550.endprint