多肽修飾載紫杉醇PLGA微球的制備技術＊

袁曉燕 劉為青 董堅 高嫦娥 劉冬 袁明龍

（1.昆明醫科大學第三附屬醫院·云南省腫瘤醫院，云南 昆明6 500118；2.昆明醫科大學第一附屬醫院生物治療中心，云南 昆明 650032；3.云南民族大學 化學與生物技術實驗室，云南 昆明 650500）

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種四環二萜類化合物，為一類抗微管活性藥物，對許多惡性腫瘤細胞顯示了強大的殺傷性，它能與細胞微管蛋白結合，促進微管聚合及排列異常，擾亂細胞分裂過程中微管的動態平衡，從而殺死細胞［1，2］。目前，紫杉醇多用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、大腸癌、頭頸部癌等的臨床治療。療效優于臨床早期使用的蒽環類藥物，但水溶性差、治療劑量安全范圍窄而限制了其的臨床應用。市售的紫杉醇注射劑采用聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，EL）／無水乙醇（50∶50，V／V）配制，其中聚氧乙烯蓖麻油會引起嚴重的過敏反應及高血壓［3－5］。

國際癌癥研究機構（IARC）報道每年有超過1000萬癌癥新發病例，全世界每年約600 萬患者死于癌癥，化療期間產生耐藥性是腫瘤患者復發、轉移，甚至死亡的關鍵［6，7］。微球為新 型載藥體 系，可攜帶DNA、多肽、藥物等進入細胞，靶向性載藥微球能特異性的作用于腫瘤細胞，減少傳統化療藥物的毒副作用，增加藥物對耐藥性腫瘤的療效，且能為病人提供個體化的治療［6－9］。乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）為一種高分子材料，具有生物相容性好、可降解緩釋控釋等優勢，已被美國FDA 批準用于臨床［10，11］。為了克服傳統化療藥物的不良反應，降低紫杉醇的毒副作用及提高治療靶向性，本研究經過不斷探索成功制備了經三陰性乳腺癌特異性轉導多肽PI修飾的載紫杉醇PLGA 微球［12－14］，微球載藥技術與靶向生物分子的成功聯合為以后靶向載藥體系的構建提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高速分散勻質機（T18，IKA，Germany）；恒速電動攪拌器（JJ－1B，澳華儀器有限 公司，江蘇常州）；臺式高速離心機（TGL20M，凱達實驗儀器有限公司，江蘇鹽城）；高效真空冷凍干燥機（LMC－2，Chirist Germany）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200series，USA）；C18色譜柱（5um，250mm×4.6mm，WATERS）掃描電子顯微鏡（HITACHI，S－3000，Japan）；激光粒度分析儀（Winner 2000，濟南微納顆粒儀器股份有限公司）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，DP73，Japan）。

1.1.2 試劑 紫杉醇（Paclitaxel，云南漢德生物技術有限公司，純度＞99.3%）；乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA，LA／GA＝50∶50，相對分子量為14970，云南民族大學化學與生物技術實驗室）；聚乙烯醇（PVA，成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（色譜級，MREDA 科技有限公司）；MICRO PES 聚醚砜濾膜（0.22μm，MEMBRANA 公司，德國）；1－乙基－3－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC.HCL，adamas－beta瑞士）；N－羥基琥珀酰亞胺（NHS，adamas－beta瑞士）；2－（N－嗎啡啉）乙磺酸（MES，adamas－beta瑞士）；三陰性乳腺癌特異性轉導多肽（FITC－PI）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 載紫杉醇的PLGA 微球（PTX／PLGA 微球）的制備 精密稱取20mg的紫杉醇、0.8g的PLGA 于試管中，加入5ml的二氯甲烷溶解，用高速分散勻質機分散2min（30000r／min）得到有機相。而后在高速分散機的攪拌下將有機相緩慢注入1%的聚乙烯醇水相中，分散5min（30000r／min）后獲得o／w 狀態的乳液，整個過程需在冰浴條件下進行。將得到的乳液緩慢加入到遠大于其體積的5%的異丙醇溶液中，用恒速攪拌機攪拌5h，以使二氯甲烷充分揮發。最后將得到的微球混懸液高速離心10min（12000r／min），收集沉積下來的微球用超純水洗滌3 遍以除去未包載的藥物及乳化劑，在真空冷凍干燥條件下過夜，得到白色凍干粉。

1.2.2 FITC－PI修飾的載紫杉醇PLGA 微球（PIPTX／PLGA 微球）的制備 精密稱取0.2g的PTX／PLGA－NPs于10ml的MES緩沖液（pH＝5.6）中，超聲下分散，加入含0.7M NHS和0.1M EDC 的MES緩沖液1ml反應1h，以使PLGA 微球上的羧基充分活化。收集活化后的微球，用MES 緩沖液（pH ＝5.6）洗滌3遍以去除未反應的NHS和EDC，接著加入5ml的PBS緩沖液（pH＝7.2）形成微球懸液，將熒光標記的PI多肽（FITC－PI）加入懸浮液中，于磁力攪拌器上低溫避光攪拌過夜，使PTX／PLGA 微球的活化羧基與PI 多肽的氨基脫水偶聯得到PI－PTX／PLGA微球，真空干燥后避光低溫保存。

1.2.3 掃描電子顯微鏡觀察微球形態 取少量微球凍干粉末于樣品臺上，用洗耳球吹散開，噴金，放于掃描電鏡下觀察。分別觀察PLGA 空白微球、PTX／PLGA 微球、PI－PTX／PLGA 微球在掃描電鏡下的形態。

1.2.4 微球粒徑測定 將微球加入超純水中，以攪拌和超聲使樣品在介質中充分分散，采用光散射原理測量微球水力學直徑。

1.2.5 包封率和載藥量的測定 采用高效液相色譜法（HPLC）測定。色譜條件：流動相為乙腈－水（50∶50）；流速為1.0ml／min；柱溫為30℃；檢測波長為227nm；進樣量為20μl。

紫杉醇原藥標準曲線測定：精密稱取紫杉醇原藥25mg于250ml的量瓶中，加入流動相溶解，并定容至刻度線，得到濃度為0.1mg／ml的紫杉醇儲備液。分別取適量儲備液于25ml的量瓶中，以流動相稀釋至刻度 線，得到終濃 度分別為1.0、2.0、5.0、20.0、50.0μg／ml的紫杉醇標準液。以峰面積（Y）為縱坐標，標準液濃度（X）為橫坐標得標準曲線。

微球中所含紫杉醇量的測定：稱取微球（PTX／PLGA 微 球、PI－PTX／PLGA 微 球）20mg 于25ml的量瓶中，用如上方法配制樣品液，測得樣品液中所含紫杉醇的峰面積，帶入標準曲線方程得到紫杉醇濃度，反復測量取平均值。以下列方程式求得載藥量和包封率：

1.2.6 熒光顯微鏡觀察PI與載藥微球的偶聯 取少量PI－PTX／PLGA 微球于試管中，加入超純水，以超聲充分分散，將懸液滴于載玻片上置于熒光顯微鏡下觀察，以藍光激發PI所帶熒光染料。

2 結果

2.1 微球形貌和粒徑分析：本研究采用乳化－溶劑揮發法成功制備了PLGA 微球。掃描電鏡觀察到微球表面光滑、完整，未見明顯空隙，分散良好（圖1）。與空白PLGA 微球相比PTX／PLGA 微球 及PI－PTX／PLGA 微球粒徑略有增大，可能與包載了藥物或與多肽連接有關，這與激光粒度儀分析的結果一致。由圖1（C）可見以化學的方式將多肽的氨基與PTX／PLGA－NPs上的羧基相連，并未破壞微球的結構和增加微球之間的粘連。

圖1 掃描電鏡微球形貌所見Figure 1 Microsphere by scanning electron microscope

2.2 FITC－PI修飾微球后的熒光顯像 PI與PTX／PLGA 微球經過EDC和NHS化學連接后，經熒光顯微鏡檢測（圖2）顯示熒光信號分布在微球表面，覆蓋率高，對照組微球未見熒光信號。

圖2 熒光顯微鏡檢測FITC－PI在PTX／PLGA微球表面的分布（×200）Figure 2 Distribution of FITC－PI on PTX／PLGA microspheres（×200）

2.3 微球載藥量和包封率的測定 高效液相色譜法（HPLC）測得標準品峰面積，以此繪圖得標準曲線方程式：Y＝33.783X＋2.7178（R2＝1），表明紫杉醇在1.0μg／ml～50.0μg／ml濃度范圍內線性關系良好。

HPLC法測定兩種載藥微球樣品液中所含紫杉醇峰面積，記錄色譜圖（圖3）。并以相同的色譜條件對空白NPs和PI－FITC進行檢測。結果示：紫杉醇的峰保留時間出現在10min附近，PTX／PLGA 微球及PI－PTX／PLGA 微球樣品液在此段時間也有出峰，而空白PLGA 微球和FITC－PI在227nm 處相同色譜條件下并無吸收峰，因此不會干擾藥物含量測定，由此表明微球成功包載了紫杉醇。PTX／PLGA 微球的載藥量和包封率分別為2.8%和91%，而PI－PTX／PLGA 微球的載藥量和包封率略有降低為2.5%和84%，多是由于PTX／PLGA－NPs重懸于水溶液與多肽結合的過程中PTX／PLGA－NPs表面的紫杉醇丟失所致。

圖3 HPLC 色譜圖Figure 3 HPLC chromatogram

3 討論

2006年歐洲科學與技術機構（ESTO）的調查顯示全球有超過150個國家正在研究載藥微球，約有24種已用于臨床［15］。近幾年來，納米材料的研究和應用發展迅速，其具備了其他材料所沒有的獨特作用：納米材料制備的微球可依據疾病需求選擇大??；納米粒可通過細胞內吞作用攜帶藥物進入細胞，減少了耐藥細胞對藥物的外排；納米粒表面能與蛋白等物質結合，靶向性的作用于病變組織［16，17］。現代分子生物學的發展已經證實了腫瘤的發生、侵襲和轉移與腫瘤細胞基因組上的突變和異常表達相關［18，19］，基因組學和蛋白組學的發展使得腫瘤細胞表面特異性靶點被識別［20］，腫瘤靶點相關性的載藥微球受到醫學界廣泛關注，靶向性的載藥微球能提高靶細胞的藥物攝取率使藥物更大程度的聚集在病變組織、改善疾病療效、降低藥物毒副反應［15，17，21－23］。

乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種成熟的可生物降解的高分子聚合物，在體內分解為乳酸和乙醇酸單體，并通過三羧酸循環代謝。PLGA 塑形性好，能包載不同類型的藥物，減少藥物在體內運輸過程中的降解，具有緩釋、控釋、表面易修飾作用［24，25］。溶劑揮發法為制備PLGA 微球常用方法，紫杉醇為疏水性藥物，能很好的溶于有機溶劑，采用O／W 狀態的乳化－溶劑揮發法制備載紫杉醇的PLGA 微球時能獲得很高的包封率［26］。

實驗采用的高分子材料PLGA 含有大量羧基，在EDC／NHS交聯體系中充分活化后，能與多肽攜帶的氨基通過脫水縮合形成酰胺鍵（R－CO－NH－R）。本研究通過掃描電鏡、激光粒度儀、高效液相色譜法及熒光顯微成像證實化學連接方法并沒有破壞PLGA 微球的結構，此法獲得的微球于超純水中分散性好，無明顯粘連和聚集，經多肽修飾后的載藥微球仍保持著較高包封率。多肽修飾的微球白色凍干粉在超純水中分散后置于熒光顯微鏡下觀察可見微球表面布滿綠色熒光，而對照組并沒有熒光信號，證明化學交聯法能將多肽牢固的連于PLGA 微球上，穩定性好，易于儲存。

4 結論

本實驗成功構建了經多肽修飾的新型載紫杉醇PLGA 微球，該藥有望降低市售紫杉醇劑型的不良反應，提高紫杉醇的臨床療效和靶向性。此方法的建立為其他靶向性生物分子（如：細胞轉導域、單克隆抗體等）與載藥微球的聯合提供了新的途徑。

【參看文獻】

［1］Rowinsky EK，Donehower RC.PACLITAXEL（TAXOL）［J］.N ENGL J MED，1995，332（15）：1004－1014.

［2］Wertz IE，Kusam S，Lam C，et al.Sensitivity to antitubulin chemotherapeutics is regulated by MCL1and FBW7［J］.Nature，2011，471：110－114.

［3］Singla AK，Garg A，Aggarwal D.Paclitaxel and its formulations［J］.International Journal of Pharmaceutics，2002，235：179－192.

［4］Feng SS，Mu L，Win KY，et al.Nanoparticles of Biodegradable Polymers for Clinical Administration of Paclitaxel［J］.Current Medicinal Chemistry，2004，11（4），413－424.

［5］Liggins RT，Amours SD，Demetrick JS，et al.Paclitaxel loaded poly（L－lactic acid）microspheres for the prevention of intraperitoneal carcinomatosis after a surgical repair and tumor cell spill［J］.Biomaterials，2000，21：1959－1969.

［6］Iyer AK，Singh A，Ganta S，et al.Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65：1784－1802.

［7］Swanton C，Marani M，Pardo O，et al.Regulators of Mitotic Arrest and Ceramide Metabolism Are Determinants of Sensitivity to Paclitaxel and Other Chemotherapeutic Drugs［J］.Cancer Cell，2007，11：498－512.

［8］Xu S，Olenyuk BZ，Okamoto CT，et al.Targeting receptor－mediated endocytotic pathways with nanoparticles：Rationale and advances［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65：121－138.

［9］Caldorera－Moore ME，Liechty WB，Peppas NA.Responsive Theranostic Systems：Integration of Diagnostic Imaging Agents and Responsive Controlled Release Drug Delivery Carriers［J］.Accounts of Chemical Research，2011，44（10）：1061－1070.

［10］Kou G，Gao J，Wang H，et al.Preparation and Characterization of Paclitaxel－loaded PLGA Nanoparticles Coated with Cationic SM5－1Single－chain Antibody［J］.Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，40（5）：731－739.

［11］Vasir JK，Labhasetwar V.Biodegradable Nanoparticles for Cytosolic Delivery of Therapeutics［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59（8）：718－728.

［12］Dong J，Liu WQ，Jiang AM，et al.A novel peptide，selected from phage display library of random peptides，can efficiently target into humanbreast cancer cell［J］.Chinese Science Bulletin，2008，53（6）：860－867.

［13］劉為青，董堅，趙德萍，等.乳腺癌細胞高親和融合多肽蛋白的表達以及靶向轉運［J］.基礎醫學與臨床，2009，29（3）：229－233.

［14］耿計偉，董堅，劉為青，等.乳腺癌特異性多肽介導的HSV－TK／GCV 系統的構建及其靶向殺傷效應［J］.Chin J Cancer Biother，2011，18（4）：383－388.

［15］Wang AZ，Gu F，Zhang LF，et al.Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic Applications［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8（8）：1063－1070.

［16］Patlak M.Nanotechnology Takes a New Look at Old Drugs［J］.NEWS，2010，102（23）：1753－1755.

［17］Farokhzad OC，Cheng JJ，Teply BA，et al.Targeted nanoparticleaptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo ［J］.PNAS，2006，103（16）：6315－6320.

［18］Riccio G，Avino CD，Raines RT，et al.A novel fully human antitumor ImmunoRNase resistant to the RNase inhibitor［J］.Protein Engineering Design ＆Selection，2013，26（3）：243－248.

［19］Shah SP，Roth A，Goya R，et al.The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple－negative breast cancers［J］.Nature，2012，486：395－399.

［20］Acharya S，Sahoo SK.PLGA nanoparticles containing various anticancer agents and tumour delivery by EPR effect［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2011，63：170－183.

［21］Levy－Nissenbaum E，Radovic－Moreno AF，Wang AZ，et al.Nanotechnology and aptamers：applications in drug delivery［J］.Trends in Biotechnology，2008，26（8）：442－449.

［22］Derycke ASL，Kamuhabwa A，Gijsens A，et al.Transferrin－Conjugated Liposome Targeting of Photosensitizer AlPcS4to Rat Bladder Carcinoma Cells［J］.Journal of the National CancerInstitute，2004，96（21）：1620－163.

［23］Changa J，Jallouli Y，Kroubia M，et al.Characterization of endocytosis of transferrin－coated PLGA nanoparticles by the bloodbrain barrier［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，379：285－292.

［24］Danhier F，Ansorena E，Silva JM，et al.PLGA－based nanoparticles：An overview of biomedical applications［J］.Journal of Controlled Release，2012，161：505－522.

［25］Enlow EM，Luft JC，Napier ME，et al.Potent Engineered PLGA Nanoparticles by Virtue of Exceptionally High Chemotherapeutic Loadings［J］.Nano Lett，2011，11：808－813.

［26］O'Donnell PB，McGinity JW.Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，1997，28：25－42.