硫化砷誘導多發性骨髓瘤細胞株U266細胞凋亡研究

王娟 姚瑤 陳麗娟

砷劑雖然是一種毒性藥物，但作為傳統中藥成分用于治療疾病亦歷史悠久。于20世紀70年代，我國哈爾濱學者利用含砒霜即三氧化二砷(AS2O3)的民間驗方“癌靈1號”治療急性早幼粒細胞白血病(APL)取得良好療效［1］，使砷劑這一古老的中藥煥發了新的光彩，目前已用于多種腫瘤的治療。多發性骨髓瘤(MM)是惡性漿細胞增殖性疾病，是不可治愈的血液系統惡性腫瘤，本文觀察了硫化砷(As4S4)對MM細胞株U266細胞凋亡效應，并對其機制作了初步探討。

1 資料和方法

1.1 細胞培養細胞接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養液(Gibco BRL公司)中，飽和濕度條件下，37℃、5%CO2中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 細胞增殖活性測定采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法［2］。U266細胞以1×108/L接種于96孔培養板中，在終濃度為1、2、3、4 μmol/L As4S4作用下培養48 h，離培養終點4 h加入MTT，繼續培養4 h，加入DMSO，酶標儀于570 nm處測吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率和半數抑制濃度(IC50)。細胞活率由臺盼藍拒染法檢測，根據處理組存活細胞數與死細胞數的比例來計算。用細胞離心涂片器(Shandon，Runcorn，UK)收集細胞至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學顯微鏡下觀察。生長抑制率及細胞活率按如下公式計算:生長抑制率=(對照組細胞數-處理組細胞數)/對照組細胞數;細胞活率=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)。

1.3 流式細胞儀分析細胞周期、annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)

1.3.1 細胞周期分析:參照文獻［3］，收集(1～2)×106細胞用70%的冷乙醇在-20℃固定過夜，經PBS(phosphate-buffered saline)緩沖液充分漂洗后，用含1%核糖核酸酶(RNase)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(pH 7.4)37℃處理30 min，并用250 μg/ml碘化丙啶染色。DNA含量分布由流式細胞儀檢測。所有數據由Beckman Coulter公司的Multicycle軟件收集、存儲和分析。

1.3.2 Annexin-V分析:使用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Annexin V和碘化丙啶(PI)雙染法檢測細胞凋亡，根據BD Biosciences公司提供的說明書操作。取(1～2)×105細胞，經PBS漂洗后加100 μl結合緩沖液，重懸細胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10 μl PI避光孵育15 min后加400 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測。

1.3.3 線粒體跨膜電位檢測:參照文獻［4］，取5×105細胞，PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123 37℃孵育30 min，PBS漂洗1次，加入終濃度10 μg/ml PI 4℃暗處放置30 min，經流式細胞儀檢測。

1.3.4 活性氧的測定方法:細胞內活性氧測定方法參照文獻［5］方法進行，二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強度與細胞內活性氧水平呈正比。將藥物處理的細胞(1×105)經過磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，重懸于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA(sigma，USA)的PBS中，以未加染料的樣品作為對照，37℃孵育20 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測5000個活細胞的熒光強度。

2 結果

2.1 As4S4對U266細胞增殖抑制和殺傷作用我們觀察了As4S4對MM細胞U266的影響，發現As4S4呈時間和劑量依賴的方式抑制U266細胞的生長，同時伴有細胞活率的降低。經48 h處理后生長抑制率在1、2、3、4 μmol/L濃度時分別為32.8%、39.8%、57.8%和64.6%;活率在0、1、2、4 μmol/L時分別為95.9%、87.7%、72.6%和42.6%，見圖1。因此選擇As4S4 4 μmol/L作為藥物處理濃度。

圖1 As4S4對U266細胞增殖抑制和殺傷作用

2.2 As4S4誘導U266細胞凋亡4 μmol/L As4S4處理U266細胞呈現出細胞形態學改變:染色體凝聚、細胞核破裂而細胞膜保持完整等凋亡特征，見圖2A。annexin V-FITC/PI雙標結果顯示，48 h時凋亡細胞占48.5%，見圖2B。線粒體跨膜電位檢測顯示線粒體跨膜電位輕度降低，見圖2C。

2.3 As4S4處理U266細胞DNA含量分布U266細胞經4 μmol/L As4S4處理后DNA含量檢測顯示細胞周期阻滯在G1期，G1期由53.4%增加到83.7%;而S期明顯降低，由35.3%降低至3.4%，結果見圖2D。

2.4 As4S4增加U266細胞活性氧濃度我們采用DCFHDA檢測As4S4處理U266細胞活性氧，發現As4S4作用于U266細胞12 h時活性氧水平增高，而24 h時活性氧恢復到正常水平。結果見圖3。

3 討論

MM在歐美國家的年發生率是(2～5)/10萬人口，在我國為1/10萬人口。幾十年來一直采用激素和細胞毒性藥物聯合化療，盡管近年來加用反應停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療，但仍是一種不能治愈的血液系統腫瘤。砷劑用于治療惡性腫瘤歷史悠久，研究顯示AS2O3具有抑制MM細胞生長和誘導MM細胞凋亡作用［6］。As4S4亦是傳統中藥的主要成分，As4S4治療白血病臨床效果顯著，不良反應較小，As4S4與氧化砷雖同為砷劑，但在分子結構、砷的價態、給藥途徑、作用特點等方面存在很大差異，作用機制亦不同。As4S4對于MM的作用尚屬未知，對其進行深入研究很有必要。

圖2 4 μmol/L As4S4誘導U266細胞凋亡作用

圖3 4 μmol/L As4S4誘導U266細胞ROS產生DCFHDA流式細胞儀檢測其熒光強度

我們的研究結果顯示As4S4對MM細胞株U266細胞具有生長抑制效應，此作用呈現時間和劑量依賴性，在抑制生長的同時伴有細胞活率的降低，同時細胞形態學上伴有凋亡特征。DNA含量的分析顯示As4S4能誘導U266細胞周期靜止，大部分細胞被阻滯在G1期，從側面證實了其增殖抑制效應。部分化療藥物可使處于周期靜止期的細胞進入凋亡階段。我們用檢測細胞早期凋亡最敏感的指標Annexin V檢測了其誘導U266細胞凋亡活性，結果表明As4S4具有誘導U266細胞凋亡效應。細胞凋亡存在外源性和內源性2種途徑，在內源性細胞凋亡信號通路中發生凋亡的細胞線粒體跨膜電位會降低，我們用Rh123檢測了As4S4處理U266細胞時線粒體跨膜電位改變，發現線粒體跨膜電位輕度降低，說明其誘導細胞凋亡作用部分通過內源性細胞凋亡途徑，即線粒體信號通路發揮作用。

許多化療藥物是通過影響細胞內自由基水平才實現其抗腫瘤作用的。常用化療藥阿霉素、絲裂霉素、放線菌素代謝時產生半醌自由基，它能促進核膜與線粒體膜的脂類氧化［7］。近年的研究認為活性氧是細胞凋亡的信號之一［8］，Yi等［9］報道As2O3通過誘導NB4細胞線粒體產生活性氧類(ROS)而發揮誘導細胞凋亡活性。線粒體是ROS產生的主要場所，內質網(ER)同樣會導致ROS的生成，線粒體對于內質網壓力(ER stress)誘導的ROS累積和凋亡的發生亦具有重要意義，ROS在ER stress誘導的細胞凋亡中發揮重要作用［10］。我們檢測結果顯示12 h時熒光強度明顯增強，24 h熒光強度恢復正常，說明As4S4在作用早期可增加U266細胞ROS濃度，從而啟動細胞凋亡。ROS的產生不僅可通過線粒體通路誘導細胞凋亡，亦可經ER stress通路誘導U266細胞凋亡。

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