表沒食子兒榮素沒食子酸酯對慢性阻塞性肺疾病模型小鼠糖皮質激素敏感性的影響

朱英杰 王慕鵬 竭 晶 宋 磊 彭麗萍

(吉林大學第一臨床醫學院，吉林 長春 130021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國常見的慢性呼吸道疾病，據世界衛生組織(WHO)估計，至 2020年COPD可能上升為世界第三大致死病因，成為我國最大的疾病負擔〔1〕。糖皮質激素(GC)作為目前臨床上應用廣泛且有效的抗炎癥藥物，在 COPD 治療過程中發揮著舉足輕重的作用。然而長期的激素治療可能出現“糖皮質激素抵抗”現象，嚴重影響其治療效果〔2〕。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶的一種主要多酚成分，綠茶的鐵鰲和、抗氧化、抗炎、抗癌及神經保護等作用與 EGCG密切相關，而 EGCG對 COPD患者是否具有促進GC敏感性的作用及機制尚未見報道。本研究以小鼠肺泡上皮細胞系MLE12細胞為研究對象，探討EGCG對煙草提取物(CSE)誘導的GC抵抗的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 清潔級C57/BL6小鼠由吉林大學基礎醫學院動物中心購置；脂多糖、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒為日本同仁公司；組蛋白去乙酰化酶(HDAC)-2 抗體，美國Abcam公司；EGCG，長沙三福生物科技有限公司。

1.2CSE制備 使用前30 min 準備，將香煙點燃后，其過濾嘴一端連接橡皮管，橡皮管的另一端連接洗耳球。根據操作方式，提前測量洗耳球平均容量。準備一只空的密閉瓶，含有10 ml DMEM培養基，吸取約300 ml的煙霧注入瓶中，搖勻，使煙霧融入DMEM中，即為原液〔3〕。

1.3COPD小鼠模型的建立 參照文獻〔4〕制作COPD小鼠模型。將脂多糖(LPS)配制成 1 mg/ml的溶液，4℃保存。造模開始第 1、14天將配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入氣道內，第2～13天、第15～28天，每日將小鼠放在60 cm×40 cm×50 cm的儲物箱中被動吸煙，每次每籠小鼠1 h，5只小鼠/籠，2次/d，每次間隔4 h。將點燃的香煙放在鼠籠架上，讓小鼠被動吸煙。COPD模型小鼠造模共28 d。

1.4小鼠肺泡灌洗液(BALF)的分離 COPD小鼠模型造模成功后，按照參考文獻〔4〕，取得COPD小鼠模型BALF，1 500 r/min離心10 min，細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，將重懸液分為對照組、CSE組、地塞米松(Dex)+CSE組、EGCG+CSE組、EGCG I+Dex+CSE組、EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組，使用實時定量PCR(RT-PCR)分別測定重懸細胞總數、巨噬細胞數和中性粒細胞數。

1.5EGCG對MLE12細胞活性影響的測定 分別使用5、10、50、100 μl EGCG刺激MLE12細胞，使用CCK-8試劑盒測定細胞活性(按照說明書操作)。

1.6MEL12細胞炎性因子mRNA測定 用LPS(500 ng/ml)處理18 h，用Trizol試劑分離細胞總RNA，按照說明書操作。分光光度計測定RNA的濃度，通過Prime-Script RT-PCR將1 μg RNA轉化成cDNA。RT-PCR在0.2 ml PCR管中進行，SYBR green染色劑，使用定制PCR主混合物95℃10 min，接著40個循環的95℃10 s，60℃ 30 s。用GAPDH標準化分析相對基因表達mRNA表達。

1.7MLE12細胞上清炎癥因子的測定 收集對照組、CSE組、Dex+CSE組、EGCG+CSE組、EGCG Ⅰ+Dex+CSE組、EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組細胞上清，使用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒測定炎癥因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達量。

1.8Western印跡測定MLE12細胞中HACD-2蛋白表達量 將MLE12細胞分為對照組、CSE組、EGCG Ⅰ+CSE組、EGCG Ⅱ+CSE組和EGCG Ⅲ+CSE組，用HDAC-2抗體，采用Western印跡方法測定五組MLE12細胞中HDAC-2蛋白的表達。

1.9統計學方法 應用SPSS17.0 軟件，多組間顯著性檢驗采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結 果

2.1EGCG對MLE12細胞活性的影響 與對照組(設為1)相比，5、10、50、100 μmol/L EGCG刺激MLE12細胞，對細胞的活性并無影響(分別為1.07±0.19，0.92±0.20，1.04±0.21，0.95±0.22，均P>0.05)。

2.2EGCG減輕CSE誘導的炎癥反應 EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組MLE12細胞中及細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3EGCG對COPD模型小鼠呼吸道中的炎癥反應的影響 使用25 μl和100 μl EGCG與CSE同時作用BALF重懸細胞中細胞數明顯降低、巨噬細胞明顯升高、中性粒細胞明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2，表3。

表1 各組BALF細胞總數、巨噬細胞、中性粒細胞水平比較

與其余5組比較：1)P<0.01

表2 各組IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比較

與其余5組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表3 各組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比較

與其余5組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4EGCG促進HDAC-2的活性 50 μl和100 μl EGCG與CSE同時作用于MLE12細胞，HDAC蛋白表達量顯著增加，而磷酸化HDAC-2(p-HDAC-2)蛋白表達量顯著下降，差異有統計學意義(均P<0.01)。見圖1，表4。

圖1 Western印跡測定HDAC-2及p-HDAC-2蛋白表達量

組別HDAC-2p-HDAC-2對照組1±0.261±0.17CSE組0.29±0.083.46±0.49CSE+EGCG Ⅰ組0.35±0.062.74±0.51CSE+EGCG Ⅱ組0.89±0.241)1.38±0.221)CSE+EGCG Ⅲ組1.17±0.311)1.34±0.271)

與其余3組比較：1)P<0.01

3 討 論

COPD是外界環境因素和宿主因素交互作用的結果，主要特征是持續氣流受限，且不完全可逆。氣道炎癥是COPD主要發病機制，由吸煙引起的慢性氧化應激也在COPD發病中起重要作用，GC作為目前臨床上應用廣泛的抗炎癥藥物，是治療COPD的重要藥物之一〔5〕，在 COPD 治療中發揮著舉足輕重的作用。然而臨床上COPD患者對GC的敏感性遠不如支氣管哮喘，沙特胸科協會的最新一項調查顯示，只有55%的被調查者認為吸入GC能有效改善COPD患者的生活質量〔6〕。長期的激素治療，可能出現所謂的“GC抵抗”現象，增加了激素副作用的發生。GC抵抗的相關機制包括HDAC-2活性下降、GC受體異常、核因子(NF)-κB激活通路缺乏等〔7〕。本研究發現，COPD小鼠氧化應激反應模型中炎癥反應增強，而HDAC-2蛋白表達降低，推測COPD患者的GC抵抗與HDAC-2活性降低有一定的聯系，但具體調控通路，本課題組還需進一步驗證。

近年來，中藥單體對COPD的調節作用及機制的研究日漸增多，可通過多途徑、多環節調節，如黃芩苷通過抑制IL-1β、IL-8、IL-6和TNF-α等抑制COPD的炎癥反應；穿心蓮內酯很可能通過上調Nrf-2活性增加抗氧化基因表達從而對COPD有抑制作用〔8〕；姜黃素通過維持HDAC-2含量恢復GC類敏感性，從而可作為GC類聯合用藥治療COPD。EGCG是綠茶的一種主要多酚成分，通過增強抗氧化途徑抑制小鼠的狼瘡性腎炎；抑制人支氣管上皮細胞中煙草誘導的NF-κB激活；通過Nrf-2-Keap1通路增強抗氧化活性，抑制肺纖維化中的炎癥反應，但EGCG是否可通過抗氧化進而增加COPD病人對GC的敏感性還不清楚。本研究發現，EGCG可顯著抑制煙草誘導產生的氧化應激，如抑制炎癥反應，增加COPD模型鼠中巨噬細胞量，降低中性粒細胞含量，并上調MLE12中HDAC-2含量，發揮抗炎和抗氧化作用。這為進一步研究其抗氧化作用機制及恢復COPD病人對GC類藥物敏感性奠定了基礎。