2014年山西運城臨床患者乙型腦炎病毒E分子生物學特征及基因分型研究

趙秋霞 陰懷清

2014年山西運城臨床患者乙型腦炎病毒E分子生物學特征及基因分型研究

趙秋霞 陰懷清

目的 初步了解2014年山西省運城地區病毒性腦炎患者中乙型腦炎病毒E基因分子生物學特征和基因型別分布特征。方法 采集19例臨床診斷為病毒性腦炎患者的腦脊液標本, 提取核酸通過巢式聚合酶鏈式反應(nPCR)擴增乙型腦炎病毒基因片斷, 采用生物信息學軟件對病毒E基因區段核苷酸和氨基酸序列進行分子生物學特征分析并與通過構建系統進化樹與國內外不同年代和地域分離的覆蓋5個基因型別的乙型腦炎病毒進行基因型別研究。結果 19例山西運城腦炎患者標本中有2例為乙型腦炎病毒核酸陽性, 基因分型結果顯示均為基因Ⅰ型乙型腦炎病毒。結論 2014年山西運城地區病毒性腦炎患者中乙型腦炎病毒為基因Ⅰ型, 與毒力相關的8個位點與乙型腦炎病毒P3一致, 沒有發生突變, 不會影響病毒毒力。理論上表明, 目前使用的乙型腦炎病毒疫苗對當地的乙型腦炎病毒仍具有保護力。

蟲媒病毒；乙型腦炎病毒；序列分析；種系發生

流行性乙型腦炎又稱為日本腦炎(JE), 是由攜帶乙型腦炎病毒的節肢動物通過叮咬人畜傳播造成的傳染性疾病。乙型腦炎首次于1924年在日本報道, 此后相繼在亞洲以及南太平洋地區傳播流行。近年來乙型腦炎不斷發生爆發式流行,我國最近的一次乙型腦炎病毒大流行發生在2006年［1］, 山西運城地區發生乙型腦炎80余例, 死亡20余人。乙型腦炎已經成為引起全世界關注的重要的公共衛生問題。

乙型腦炎的病原體為乙型腦炎病毒(JEV), 屬于黃病毒科, 黃病毒屬。基因組為11 kb的單股正鏈RNA, 可編碼3個結構蛋白：C、M、E, 與病毒致病性和免疫原性重要相關。編碼7個非結構蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。根據基因組中編碼E蛋白的核苷酸的差異, 將乙型腦炎分為5個基因型, 分別為基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。乙型腦炎是一種疫苗可預防性疾病, 我國目前使用的乙型腦炎疫苗株P3株和Sa14-14-2株, 此兩株病毒株均為基因Ⅲ型乙型腦炎毒株。根據最新的乙型腦炎病毒分子流行病學研究結果顯示［2,3］, 目前流行的乙型腦炎病毒優勢基因型別已經發生了轉化, 由基因Ⅲ型轉化為基因Ⅰ型［4,5］。有文獻報道,臨床出現接種乙型腦炎疫苗后仍感染乙型腦炎病毒的病例,經分子基因特征分析為基因Ⅰ型乙型腦炎病毒感染［6］。因此,開展運城地區乙型腦炎病毒基因分型和分子特征研究對于明確運城地區流行的乙型腦炎病毒基因型別, 了解運城乙型腦炎病毒的分子進化特征, 評估目前使用的乙型腦炎病毒疫苗的免疫保護力的研究具有重要意義。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2014年6～10月, 收集到運城市中心醫院臨床診斷為病毒性腦炎患者的腦脊液標本19份。

1.2 RNA提取及逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美國QIAGEN公司) 提取患者腦脊液標本中病毒的總RNA, 采用Amersham Bioscience Ready-to-GoTM You First-Strand Beads (美國Amersham Pharmacia Biotech)制備cDNA。取2 μl cDNA做反應模板, 采用巢樣PCR方法進行乙型腦炎病毒特異性核酸檢測, 引物如下： PEf:ACGTTCTTCAAGTTTACAGCA; PEr：GGAAATGAAGGCTCAATCATGTG；PEfn：GATGTCAATGGC ACATCCAGT; PErn：CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC。先依次加入10×Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 5 μl、上下游引物各1 μl、exTaq酶0.75 μl、去離子31.75 μl, 充分混勻, 94℃預變性5 min, 94℃30 sec, 55℃30 sec, 72℃1.5 min, 30個循環, 72℃延伸10 min, 1%瓊脂糖電泳檢查擴增條帶, 用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR擴增產物, 送上海生工生物公司測序。

1.3 病毒序列分析 本次實驗從GenBank中選取覆蓋全部5個基因型別的49株乙型腦炎病毒的E基因序列為對照進行序列及進化分析。采用Clustal X(1.83)軟件進行序列聯配分析, BioEdit軟件進行序列編輯, 采用DNASTAR軟件進行核苷酸及氨基酸差異度分析, MEGA6完成病毒進化分析, 氨基酸位點對比分析由GENEDOC(3.2)軟件完成。

2 結果

2.1 患者標本的分子生物學檢測 從19例患者腦脊液標本中提取RNA, 反轉錄成為病毒基因組cDNA, 采用乙型腦炎病毒E基因的巢式擴增引物, 19份標本中有2份標本為乙型腦炎病毒核酸陽性病例, 陽性率10.5%。

2.2 山西運城乙型腦炎病毒的基因分型研究 從NCBI的GenBank中選擇分離自不同地區, 不同時間, 不同宿主, 覆蓋全部5個基因型別的乙型腦炎病毒病毒序列總計49株, 構建系統進化發育樹進行基于乙型腦炎病毒E基因的分型研究。結果顯示：2014年從山西運城地區腦炎患者標本中擴增的2株乙型腦炎病毒病毒株SX1401和SX1402均屬于基因型Ⅰ型, 這2株病毒聚類成一個小的分支表現出一定的地域分布特征。

2.3 山西運城乙型腦炎病毒E基因核苷酸序列特征 采用WHO推薦并在中國廣泛使用的減毒活疫苗株SA14-14-2和P3為對照, 對山西運城地區病毒性腦炎患者標本擴增的2株乙型腦炎病毒E基因區段進行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析, 結果如下：新分離的2株乙型腦炎病毒之間核苷酸和氨基酸同源性為100%；與疫苗株P3和SA14-14-2之間核苷酸同源性分別為87.4%和87.5%, 氨基酸同源性均為97.2%。乙型腦炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白為主要的結構蛋白,影響病毒毒力、入侵和免疫原性。分子量約為53 kDa, 含500個氨基酸殘基。將運城地區新分離病毒與乙型腦炎病毒疫苗株SA14-14-2和P3的E蛋白氨基酸序列進行比對發現,分別存在13個和10個基酸差異位點。乙型腦炎病毒E蛋白中的一些位點E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439是影響乙型腦炎病毒毒力的關鍵位點, 運城地區腦炎患者乙型腦炎病毒E基因序列與疫苗株P3相比8個關鍵位點均未發生改變。

3 討論

乙型腦炎病毒基因型別的分布具有比較明顯的地域分布傾向性, 其中基因Ⅰ型和Ⅲ型主要分布于溫帶和亞熱帶地區,而Ⅱ型和Ⅳ型主要分布于熱帶地區, 基因Ⅴ型乙型腦炎病毒是最古老的基因型別。最新的乙型腦炎病毒分子流行病學研究發現, 基因Ⅰ型是最年輕的基因型別, 蘊藏著豐富的相對種群多樣性, 在與基因Ⅲ型的競爭中處于優勢地位, 在乙型腦炎流行區呈現迅速擴張趨勢, 并逐漸替代原有基因型別病毒［4］。

山西省運城市地處黃河沿岸, 是乙型腦炎流行的高發區。文獻報道［2］, 運城地區1955～1997共發生乙型腦炎3341例, 死亡711例。2006年［1］, 運城市發生80余例成人型病毒性腦炎爆發流行, 無論患者腦脊液或當地采集蚊蟲標本中均同時檢測到基因Ⅰ型和Ⅲ型乙型腦炎病毒。本次調查結果顯示, 在運城19例病毒性腦炎標本中檢測到2株基因Ⅰ型乙型腦炎病毒。提示, 該地區乙型腦炎病毒基因型別與亞洲其他地域一樣, 發生了由基因Ⅰ型向基因Ⅲ型別的轉換。

乙型腦炎屬于疫苗可預防性疾病, 由于乙型腦炎疫苗的廣泛應用使得該病在我國已得到有效控制。20世紀60年代,中國使用1949年分離自腦炎患者乙型腦炎病毒毒株P3株研制出滅活疫苗, 一直沿用至今。20世紀90年代, 我國使用中國蚊蟲分離的乙型腦炎病毒(SA14株)培育出病毒減毒活疫苗(SA14-14-2株), 上述廣泛使用的乙型腦炎疫苗的病毒株均屬于基因Ⅲ型乙型腦炎病毒, 因此疫苗對不同基因型乙型腦炎病毒的免疫保護效果更是受到特別關注。乙型腦炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白為主要的結構蛋白, 影響病毒毒力,病毒入侵和病毒的免疫原性, E蛋白有8個重要的氨基酸位點與病毒抗原性密切相關。運城乙型腦炎病毒與疫苗P3株毒力相關的8個氨基酸位點沒有變異, 表明在當地目前的乙型腦炎疫苗在理論上仍具有保護效力。

［1］ 尹遵棟, 梁曉峰, 李藝星, 等.運城市2006年流行性乙型腦炎疫情調查分析.中國計劃免疫, 2007, 13(3):270-273.

［2］ 馬仙發, 李宗民, 刑運華, 等.運城地區1955年至1997年流行性乙型腦炎流行病學分析.中華流行病學雜志, 1998(19):3-6.

［3］ Erlanger TE, Weiss S, Keiser J, et al.Past, present, and future of Japanese encephalitis.Emerg Infect Dis, 2009, 15(1):1-7.

［4］ van den Hurk AF, Ritchie SA, Mackenzie JS.Ecology and geographical expansion of Japanese encephalitis virus.Annual Review of Entomology , 2009(54):17-35.

［5］ Wang HY, Takasaki T, Fu SH, et al.Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China.Journal of General Virology, 2007, 88(Pt3):885-894.

［6］ Zhang JS, Zhao QM, Guo XF, et al.Isolation and genetic characteristics of human genotype 1 Japanese encephalitis virus, China, 2009.PLoS One, 2011, 6(1):e16418.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.24.017

2015-03-13］

030001 山西醫科大學(趙秋霞)；山西醫科大學第一附屬醫院兒科(陰懷清)

陰懷清