蟒蛇肉酶解肽電噴霧多級質譜法分析

高 穎，高曉晨，李晶峰，郭曉慶，張 輝，孫佳明

(長春中醫藥大學，長春130117)

蟒蛇，又名蟒，王蛇，蚺蛇，南蛇，埋頭蛇，王字蛇，琴蛇，梅花蛇［1］，是當今世界上最原始的優質蛇種之一。蟒蛇肉在《名醫別錄》就有記載，其味甘，性溫，有小毒。除手足風痛，殺三蟲，去死肌，皮膚風毒癘風，疥辟惡瘡。具有祛風活絡，殺蟲止癢的功效，可用于風痹，癱瘓，癘風，疥廨，惡瘡 。在我國，蟒蛇主產于福建、廣東、海南、廣西、貴州、云南。近年來，蟒蛇的生存環境遭到破壞以及蟒蛇皮的市場需求加大致使蟒蛇的數量急劇下降，同時也刺激了蟒蛇的人工養殖。

生物活性肽(bioactive peptides)具有特殊的生物活性和生理功能，它一般是由3～20個氨基酸構成的多肽類物質，通常情況下，其分子量在1萬Da以下。它由氨基酸組成，但其具有氨基酸所不能比擬的功效，生物活性肽源于蛋白質，但更易被人體吸收和利用，甚至會出現原蛋白質所不具備的新功能［2-3］。本文運用現代電噴霧多級質譜法對蟒蛇肉酶解肽進行了分析研究，解析其中酶解肽的氨基酸序列。

1 材料與儀器

1.1 材料 蟒蛇肉酶解肽由長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心自制。

1.2 儀器 Agilent 6350 ESI-MS(美國 Agilent公司);GL-20G-Ⅱ型低溫超速離心機;FD-1000真空冷凍干燥機;UV-Visible Spectrophotometer;BP211D型十萬分之一電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)。

1.3 試劑 所用試劑均為色譜純。

2 方法

2.1 樣品制備 稱取1g蟒蛇肉酶解肽凍干粉，用10%MeOH定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，濾過，即得。

2.2 質譜條件［4］電離源:電噴霧離子源(ESI);檢測方式:正離子檢測;掃描范圍:m/z 50～500;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流量:10 mL/min;霧化氣壓強:0.24 MPa(35.0 psi);毛細管電壓:4 kV。

2.3 樣品分析 采用蠕動泵直接進樣到離子源，利用質譜工作站所能提供的離子信息，對樣品主要成分進行序列解析。從一級質譜圖中，主要對m/z303、374的［M+H］+準離子峰進行分析，解析其主要寡肽類成分的氨基酸序列。

3 結果

3.1 m/z303離子的序列解析 一級質譜中m/z為303的［M+H］+離子峰，說明其分子量為302，氨基酸的平均分子量為128，根據氮律分子應含奇數個氮，推斷其可能為三肽化合物。在碰撞誘導解離過程中，m/z 303離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 285離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子，m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結合肽類裂解規律的文獻報道［5-7］，推知m/z為303的離子是由丙氨酸、纈氨酸和天冬酰胺三個氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的三肽，其氨基酸序列為AVN，結構式如圖1。

圖1 m/z 303離子結構式

3.2 m/z374離子的序列解析 一級質譜中m/z為374的［M+H］+離子峰，說明其分子量為373，氨基酸的平均分子量為128，根據氮律分子應含偶數個氮，推斷m/z 374離子可能為四肽化合物。在碰撞誘導解離過程中，m/z374離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 356離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 285離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)、一分子脫水丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子;m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結合肽類裂解規律，推斷m/z 374離子是由兩個丙氨酸、一個纈氨酸和一個天冬酰胺4個氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的四肽，故m/z374離子的氨基酸序列為AAVN，結構式如圖2。

圖2 m/z 374離子結構式

4 討論

生物活性肽具有多種生物學效應，如抗氧化、免疫調節、抗高血壓、抗血栓、降低膽固醇、抑菌、抗病毒、抗腫瘤作用等，是篩選藥物的天然資源寶庫。研究發現蟒蛇肉酶解肽具有較好的抗氧化能力［8］，本文首次利用ESI-MSn對蟒蛇肉酶解肽進行了分析研究，從中解析出兩個具有代表性的酶解肽的氨基酸序列，為蟒蛇進一步合理開發應用奠定了基礎。

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