槲皮素對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞增殖與凋亡的影響

廖應(yīng)英，孫澤群，李彩麗，查火龍(.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065；.十堰市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北44000)

食管癌目前嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。有研究表明，槲皮素(quercetion)是從槲皮中提取的一種5-羥基黃酮類(lèi)化合物，為無(wú)毒中藥，具有多種生物學(xué)活性[1-3]。槲皮素作用廣泛，不僅能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用后可增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，而且在擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛等方面有多種藥理作用，這種化合物在低濃度時(shí)可以刺激人體細(xì)胞擴(kuò)散，在高濃度、凋亡情況下能消除感染或異常細(xì)胞，可作為一種潛在的抗癌藥物，臨床應(yīng)用廣泛。槲皮素可以干擾細(xì)胞酶、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號(hào)系統(tǒng)[4]，但其抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制目前仍未研究清楚。本研究通過(guò)槲皮素對(duì)人食管癌E-ca109細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為臨床抗腫瘤治療提供幫助，為進(jìn)一步探討其抗腫瘤的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 槲皮素粉劑購(gòu)于Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自四季青生物公司。

1.1.2 槲皮素的配制 取槲皮素粉劑18 mg，溶解于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中，配成母液，使用含10%新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)笵MSO終濃度小于1/1000，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及體外培養(yǎng) 人食管癌Eca109細(xì)胞(湖北省十堰市人民醫(yī)院食管腫瘤研究所提供)；體外培養(yǎng)Eca109細(xì)胞，將其接種在RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%左右新生牛血清)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目，每隔2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后傳代1次，連續(xù)傳3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響 將傳3代后的Eca109細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104mL-1到96孔板上，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，見(jiàn)細(xì)胞貼壁后加入含有不同濃度槲皮素的培養(yǎng)液各200 μL，再設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基即槲皮素0 μmol/L)。每組設(shè)5個(gè)平行孔，連續(xù)3 d共準(zhǔn)備3塊96孔板，1、2、3塊板分別培養(yǎng)72、48、24 h，之后每孔加入 MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，放置在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h后終止，傾去板中培養(yǎng)液。將每孔中加入150 μL DMSO，平板振蕩10～15 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm下測(cè)定各孔光密度(OD)值(以空白孔調(diào)零；根據(jù)公式：細(xì)胞增殖抑制率[IR(%)]=(OD對(duì)照組-OD給藥組)/OD對(duì)照組×100%計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖IR。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 用0.25%胰蛋白酶消化，離心后棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL洗滌，洗掉殘留的胰酶，然后離心5min再棄上清液，收集細(xì)胞。加入 400 μL1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，輕輕混勻，室溫下避光孵育約15 min，加入 10 μL 碘化丙啶(PI)染色劑，再次輕輕混勻，冰水中避光放置5 min。30min內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用Anova檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的抑制作用 根據(jù)結(jié)果觀察不同濃度槲皮素作用Eca109細(xì)胞24、48、72 h后，其增殖被顯著抑制，并隨著藥物濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，MTT法檢測(cè)出OD值隨著濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在作用72 h及最大濃度320 μmol/L時(shí)所得出的OD值根據(jù)公式計(jì)算出的細(xì)胞增殖IR最高，提示該濃度時(shí)細(xì)胞增殖抑制的作用最為明顯。不同濃度的槲皮素在不同時(shí)間點(diǎn)處理Eca109細(xì)胞的結(jié)果，IR隨著時(shí)間增加而升高，各組與前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.1 不同濃度槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞增殖IR的量效關(guān)系 不同濃度的槲皮素作用Eca109細(xì)胞后，得出的OD值和公式計(jì)算出的IR與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著濃度的增加，IR逐漸增加，細(xì)胞增殖抑制逐漸增強(qiáng)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明隨著槲皮素濃度的增加，其對(duì)Eca細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，與劑量呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度槲皮素作用Eca109細(xì)胞不同時(shí)間段OD 值及 IR 比較(n=9，OD490nm)

圖1 不同濃度槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞IR的影響

2.1.2 槲皮素作用不同時(shí)間對(duì)Eca109細(xì)胞增殖IR的時(shí)效關(guān)系 槲皮素在不同濃度條件下作用Eca109細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)出的OD值根據(jù)公式計(jì)算出的IR，每組濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖IR逐漸上升，每個(gè)濃度槲皮素與前一組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明不同濃度槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞的增殖抑制作用與時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯的相關(guān)性。見(jiàn)圖1。

2.2 不同濃度槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞作用24 h后檢測(cè)出的細(xì)胞凋亡率不同，隨著濃度的增加其數(shù)值逐漸升高，且明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示槲皮素促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度槲皮素作用Eca109細(xì)胞凋亡率

3 討 論

食管癌患者確診時(shí)多已是中晚期，因其早期癥狀隱匿，很多患者錯(cuò)過(guò)了外科手術(shù)的機(jī)會(huì)，預(yù)后差，生存率較低。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)食管癌的死亡率位居惡性腫瘤的第4位，年平均病死率為15/10萬(wàn)，且目前發(fā)病趨于年輕化[5-6]，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量及身體健康。因此，對(duì)該病進(jìn)行深入研究、提高臨床治療效果、改善患者的生活質(zhì)量，是當(dāng)前研究的重中之重。

自1971年美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)槲皮素在臨床白血病治療中發(fā)揮一定作用后，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制多種癌細(xì)胞的增殖，如結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膀胱癌等，同時(shí)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。槲皮素在肝細(xì)胞癌中的凋亡效應(yīng)可能為通過(guò)調(diào)節(jié)特異性蛋白1(Sp1)來(lái)發(fā)揮作用[7]。在胃癌的研究中，槲皮素能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成，主要是通過(guò)下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)。小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，槲皮素可以抑制前列腺癌組織中微血管的生成，主要通過(guò)減少小鼠體內(nèi)腫瘤微血管的密度，從而減少腫瘤組織中VEGF的表達(dá)。槲皮素可能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的化學(xué)敏感性，與單獨(dú)使用阿霉素治療相比，聯(lián)合治療可顯著抑制細(xì)胞增殖和入侵，增加細(xì)胞凋亡、上調(diào)人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達(dá)和磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(p-AKt)的表達(dá)[8]。近年來(lái)，各種研究報(bào)道了miRNAs與人類(lèi)癌癥的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)槲皮素在乳腺癌的治療中，對(duì)細(xì)胞增殖的影響在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDAMB-231有沒(méi)有轉(zhuǎn)染miR-146a的模仿或反miRNANA-146a。此外，Bax和cleaved-caspases-3主要是增加了控制和超表達(dá)miRNA-146a，但是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)是相反的[9]。這些研究結(jié)果都反映出槲皮素在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡方面均有良好的效果[10-14]。

本實(shí)驗(yàn)研究在體外培養(yǎng)Eca109細(xì)胞，以不同濃度的槲皮素作用該細(xì)胞后用MTT法檢測(cè)出槲皮素對(duì)Eca細(xì)胞的增殖抑制率，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Eca細(xì)胞的凋亡率，從而探討槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞增殖與凋亡的影響。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在不同時(shí)間的情況下，隨著槲皮素濃度的增加，各組均出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，且抑制作用逐漸遞增。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為了進(jìn)一步了解不同濃度槲皮素對(duì)E ca109細(xì)胞作用早期的抑制率情況，曾檢測(cè)作用6、12 h后對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞增殖的影響，但2個(gè)時(shí)間段的抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果對(duì)臨床治療食管癌的過(guò)程可以提供一定的幫助。目前食管癌患者確診時(shí)多數(shù)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了外科手術(shù)治療的最佳時(shí)期，只能選擇化療或放療，選擇化療時(shí)，其他抗腫瘤藥物可聯(lián)合槲皮素抑制食管癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡，提高化療效果，改善遠(yuǎn)期預(yù)后，延長(zhǎng)患者生命。

綜上所述，槲皮素可抑制食管癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。迄今為止，槲皮素的抗腫瘤作用機(jī)制研究不多，具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用有待研究，可能與抑制腫瘤組織VEGF的表達(dá)有一定的相關(guān)性。通過(guò)抑制其表達(dá)來(lái)抑制食管癌的增殖、轉(zhuǎn)移，從而控制腫瘤的發(fā)展，還可能與凋亡蛋白Bcl-2、Bax等基因的高表達(dá)有一定的相關(guān)性，目前此類(lèi)研究較少，有待進(jìn)一步研究探討。

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