Caveolin-1在卵巢漿液性囊腺癌中的表達及其臨床意義

杜曉麗 朱慧芳

1.河北省廊坊市人民醫(yī)院婦產科，河北廊坊065000；2.河北省廊坊衛(wèi)生職業(yè)學院婦產科，河北廊坊065000

Caveolin-1在卵巢漿液性囊腺癌中的表達及其臨床意義

杜曉麗 朱慧芳

1.河北省廊坊市人民醫(yī)院婦產科，河北廊坊065000；2.河北省廊坊衛(wèi)生職業(yè)學院婦產科，河北廊坊065000

目的探討基因蛋白Caveolin-1的表達在卵巢癌侵襲和轉移中的作用。方法選取2011年1月～2014年1月廊坊市人民醫(yī)院手術切除卵巢組織存檔蠟塊89例，其中卵巢漿液性囊腺瘤58例和卵巢漿液性囊腺癌31例，另取10例因其他良性卵巢病變手術切除的正常卵巢組織作為對照。應用流式細胞免疫法檢測99例卵巢組織中Caveolin-1的定量表達，分析Caveolin-1與卵巢癌侵襲和轉移的關系。結果卵巢漿液性囊腺癌中Caveolin-1的平均熒光指數（FI）為（0.66±0.27），明顯低于正常卵巢組織（1.00±0.16）和卵巢漿液性囊腺瘤（1.69±0.34），差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。有淋巴轉移的卵巢漿液性癌Caveolin-1蛋白平均FI值為（0.57±0.29），明顯低于無淋巴轉移的卵巢液性癌（0.94±0.31），差異有統計學意義（P＜0.05）；Ⅲ期的卵巢漿液性癌Caveolin-1蛋白FI值為（0.51±0.23），明顯低于Ⅰ～Ⅱ期的卵巢漿液性癌（0.92±0.24），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論卵巢漿液性囊腺癌組織中Caveolin-1的低表達促進了其侵襲和轉移，提示Caveolin-1可作為卵巢漿液性囊腺癌診斷和判斷預后的指標。

卵巢漿液性囊腺癌曰Caveolin-1曰侵襲和轉移

卵巢癌病死率居女性生殖系統腫瘤之首，嚴重威脅著婦女的生命和健康，為婦科腫瘤預后最差的腫瘤之一，其五年生存率僅20%～30%。其發(fā)病率和病死率逐年增加，發(fā)病年齡也趨向年輕化，嚴重威脅著女性生命健康。腫瘤的侵襲和轉移是影響卵巢癌患者預后的重要因素之一。Caveolin-1是近年來新認識的胞膜窖（Caveolae）的標志性蛋白，與腫瘤發(fā)生過程中細胞的惡性轉化、增殖、侵襲、轉移以及信號傳導的調控關系密切。本研究旨在通過流式細胞術（FCM）探討Caveolin-1蛋白在卵巢漿液性癌侵襲和轉移中的作用，從而評價Caveolin-1在卵巢癌惡性程度及預后判斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2011年1月～2014年1月河北省廊坊市人民醫(yī)院手術切除的卵巢組織存檔蠟塊89例，所有病例均由兩位有經驗病理醫(yī)師診斷后，經常規(guī)病理學檢查證實。其中，卵巢漿液性囊腺瘤58例，卵巢漿液性囊腺癌31例。另取10例因其他良性卵巢病變手術切除的正常卵巢組織作為對照。正常卵巢組織患者年齡23～70歲，平均（47.2±4.2）歲。卵巢漿液性囊腺瘤患者年齡24～68歲，平均（45.4±4.7）歲。卵巢漿液性癌患者在手術前均未進行過化療，年齡22～69歲，平均（46.7± 4.9）歲。按FIGO標準對31例卵巢癌進行分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，伴淋巴結轉移的16例，無淋巴轉移的15例。三組患者在年齡等一般資料方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)單細胞懸液制備法用石蠟切片機切取石蠟組織切片，每例組織塊切取切片10片，每片厚50μm，置于10mL試管，用二甲苯脫臘（24 h）；依次用100%、95%、70%、50%酒精梯度酒精水化，各20min；然后加入蒸餾水5 mL（5 min），將其置一平皿放于120目不銹鋼網上，將組織用眼科剪刀剪碎后，以眼科鑷子輕搓組織塊，同時用生理鹽水沖洗，至組織搓完為止。用300目銅鋼網將平皿中混懸液過濾去除團塊，以500～800 r/min離心沉淀細胞懸液2 min制得單細胞懸液，備測。

1.2.2 細胞免疫熒光標記（間接免疫熒光標記法）每份標本取單細胞懸液1×106/mL，0.1 mL，具體操作如下：將待檢細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）10 mL洗滌1次，1000 r/min離心5 min，棄上清液；每份樣品加入0.1mL一抗（兔抗人Caveolin-1單克隆抗體）1∶50工作液，室溫30min孵育，加入10mL PBS，洗滌1次，棄上清；每份樣品加入100μL二抗（羊抗兔FITC-IgG、羊抗鼠FITC-IgG）工作液，避光、室溫30 min孵育，加入10 mL PBS，離心同上，棄上清從而除去未結合熒光二抗；上機檢測前加入0.1 mL PBS，經500目銅網過濾，上機檢測。

1.2.3 對照樣品的設置設正常卵巢組織對照之外，還設PBS代替一抗陰性對照、加入一抗陽性對照、加入二抗陽性對照及FITC標記小鼠IgG同型對照。

1.2.4 實驗儀器使用Epics-XLⅡ型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司生產，激發(fā)波長為488 nm的15 mW氫離子激光器激發(fā)光源，Expo32ADC進行免疫熒光數據分析。

1.3 試劑

一抗即鼠抗人Caveolin-1單克隆抗體，二抗即羊抗鼠FITC-IgG，均于北京中杉金橋生物技術有限公司購買。

1.4 結果判定

基因蛋白表達的相對含量以熒光指數（fluorescence idex，FI）表示，FI=樣品蛋白表達平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中Caveolin-1蛋白表達情況

卵巢液性癌組織中Caveolin-1蛋白平均FI值（0.66±0.27）明顯低于正常卵巢組織（1.00±0.16）和卵巢漿液性囊腺瘤（1.11±0.34），差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），卵巢漿液性囊腺瘤組織中Caveolin-1的蛋白平均FI值雖稍高于正常卵巢組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 不同類型卵巢漿液性癌組織中Caveolin-1的表達情況

有淋巴轉移的卵巢漿液性癌組織中Caveolin-1蛋白表達量平均FI值明顯低于無淋巴轉移的卵巢液性癌組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。Ⅲ期的卵巢漿液性癌組織中Caveolin-1蛋白表達量平均FI值明顯低于Ⅰ～Ⅱ期的卵巢漿液性癌組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同類型卵巢漿液性癌組織中Caveolin-1的表達情況

注：FI：熒光指數

項目例數FI值P值淋巴轉移0.026無有15 16 0.94±0.31 0.57±0.29臨床分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ期0.022 23 8 0.92±0.24 0.51±0.23

3 討論

居女性各種疾病第6位、女性生殖系腫瘤第3位的卵巢腫瘤是女性最常見的腫瘤之一，其中卵巢上皮性腫瘤為卵巢腫瘤的57.4%。卵巢漿液性腫瘤在卵巢上皮腫瘤中居首位。女性生殖系腫瘤中致死率最高的卵巢癌，在女性死亡因素中5%，超過女性生殖系腫瘤病死率的50%以上。近年來，中國女性卵巢癌發(fā)病率和病死率逐年增加，嚴重威脅著女性的生命和健康。影響卵巢癌預后因素較多，癌癥致死的最主要原因是腫瘤細胞的轉移和擴散。腫瘤的增殖及凋亡失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。凋亡是一種多步驟多途徑的細胞死亡性程序，受多種基因蛋白的調控。與腫瘤細胞凋亡密切相關的蛋白——凋亡抑制蛋白（IAPs）過度表達引起的細胞凋亡受阻與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系。Caveolin-1蛋白表達與腫瘤的分化、增殖、凋亡、侵襲和轉移密切相關。

Caveolin-1是細胞膜的主要結構蛋白和標志蛋白，向內凹陷呈瓶頸狀，直徑50～100 nm的囊泡結構（Caveolae）。據其免疫性特征可將其分為Caveolin-1、Caveolin-2和Caveolae-3。其中多種細胞中Cacveolin-1廣泛存在，發(fā)揮著重要細胞的生物學功能。Caveolin-1由178個氨基酸殘基組成，編碼基因定位于7q31.1區(qū)域，分子量22 kD，是許多信號分子的支架蛋白和負性調節(jié)蛋白，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移等可能存在密切的關系。Caveolin-1在上皮細胞、脂肪細胞、纖維母細胞、平滑肌細胞和內皮細胞中表達豐富，但在發(fā)生腫瘤時會出現Caveolin-1表達異常，其異常取決于腫瘤細胞來源和各種生長因子的狀態(tài)［1-2］。Caveolin-1的功能：①細胞內吞作用，作為胞膜上凹陷結構的Caveolae，可選擇性吞噬細胞外大分子物質，并將其運輸至細胞內特定區(qū)域［3］。有研究表明Caveolin-1被破壞后，細胞對特定蛋白內吞作用減弱，表明Caveolin-1在介導細胞的內吞作用中非常重要［4］。②發(fā)揮信號通路樞紐作用。通過腳手架區(qū)Caveolin-1能與多種信號蛋白結合，從而調節(jié)細胞信號轉導，在脂質、胞膜交通及信號傳導中發(fā)揮著重要樞紐作用［5］。

目前Caveolin-1在腫瘤發(fā)生過程中的機制尚不清楚，大多數實驗支持Caveolin-1為候選的抑癌基因，與多種惡性腫瘤相關［6-9］。研究發(fā)現Caveolin-1在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌和結腸癌等腫瘤組織中的表達量降低，而在食道癌、前列腺癌、膀胱癌和骨肉瘤中的表達卻增高，并隨腫瘤分化程度下降和侵蝕能力增強而表達升高［10-14］。在腫瘤中Caveolin-1究竟發(fā)揮抑癌還是促癌作用，與腫瘤細胞的來源及類型密切相關。本研究結果顯示，卵巢漿液性囊腺癌中Caveolin-1蛋白的表達量降低，且隨卵巢癌惡性程度的增強而表達降低。卵巢癌Caveolin-1蛋白平均FI值是（0.66±0.27），明顯低于正常卵巢（1.00±0.16）和卵巢漿液性囊腺瘤（1.11±0.34），差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），提示Caveolin-1與卵巢腫瘤的惡性程度有關，符合其在某些腫瘤中的負性調節(jié)作用，曾瓊等［15］采用免疫組化法檢測15例正常卵巢組織、38例卵巢上皮性良性腫瘤組織、20例上皮性交界性腫瘤組織和38例卵巢癌組織中Caveolin-1蛋白的表達水平，研究結果表明，Caveolin-1蛋白在人卵巢癌組織中的表達明顯低于卵巢良性腫瘤及卵巢正常組織，表明其在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到腫瘤抑制因子的作用，與本研究結果基本一致。本研究結果還表明，有淋巴轉移的卵巢漿液性癌Caveolin-1蛋白平均FI值為（0.57±0.39），明顯低于無淋巴轉移的卵巢液性癌（0.94±0.31），差異有統計學意義（P＜0.05），提示Caveolin-1與卵巢漿液性癌的淋巴轉移相關，這可能與Cveolin-1通過激活各種生長信號的傳導，促進腫瘤細胞生長、增殖和轉移有關。有研究顯示，Caveolin-1在癌組織中表達越低，其淋巴結陽性率越高，患者的5年生存率越低［16］。本次研究中，Ⅲ期的卵巢漿液性癌Caveolin-1蛋白表達量平均FI值為（0.51±0.33），明顯低于Ⅰ～Ⅱ期的卵巢漿液性癌（0.92±0.24），差異有統計學意義（P＜0.05），進一步證明其有抑制腫瘤生長和發(fā)展的作用。提示Caveolin-1與卵巢漿液性癌的臨床分期、浸潤及轉移密切相關，在卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。梁菲等［17］采用免疫組化法檢測84例原發(fā)性卵巢上皮癌患者手術切除組織中Caveolin-1的表達水平，研究結果表明，Caveolin-1在卵巢癌組織中表達明顯下調（P=0.001），且其在卵巢癌組織中的表達率與組織學分級、FIGO分期、病理類型、腹水細胞學、大網膜轉移及淋巴結轉移顯著相關（P＜0.05），與本研究結果一致。

綜上所述，本研究結果表明Caveolin-1在卵巢漿液性癌浸潤和轉移過程中發(fā)揮著重要作用，對卵巢漿液性癌中Caveolin-1的表達變化進行評價對卵巢漿液性癌的診斷及預后判斷意義重大，為卵巢漿液性癌的診治提供了重要靶點。Caveolin-1在卵巢漿液性中的表達變化對評價患者的病情以及尋找有效的治療藥物具有重要的臨床意義，可能成為卵巢漿液性癌未來的研究方向。

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Expression of Caveolin-1 gene proteion in ovarian serous carcinoma and its clinical significance

DU Xiaoli ZHU Huifang
1.Department of Obstetrics and Gynecology,the People's Hospital of Langfang City,Hebei Province,Langfang 065000, China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Langfang Health Career Academy，Hebei Province,Langfang 065000,China

ObjectiveTo study the effects of Caveolin-1 expression on invasion and mestastasis of ovarian carcinoma.M ethodsExpression of Caveolin-1 gene protein in 89 paraffin-embeded samples from patientswith ovarian serous tumors from January 2011 to January 2014 in the People's Hospital of Langfang City,including 58 cases of ovary serous cystadenocarcinoma tissues and 31 cases of ovarian serous carcinoma tissues,10 cases of normal ovarian tissues were taken as control group.All tissueswere detected by flow cytometrymethod(FCM)quantitatively.The relationship between Caveolin-1 expression and invasion,mestastasis of ovarian serous carcinoma were analyzed.ResultsExpression of Caveolin-1 protein found in ovarian serous carcinomawas(0.66±0.27),which was significantly less than that in normal ovarian tissues(1.00±0.16)and ovarian serous cystadenoma(1.69±0.34),the differenceswere statistically significant(P＜0.05 orP＜0.01).The FIof Caveolin-1 protein in carcinomaswith lymphnodemetastasis(0.57±0.29)was lower than that in carcinomaswithout lymphnodemetastasis(0.94±0.31),the difference was statistically significant(P＜0.05).The FIof Caveolin-1 protein in stageⅢcarcinomas(0.51±0.23)was significantly less than that in stageⅠ-Ⅱcarcinomas(0.92±0.24),the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe low level of Caveolin-1 may be linked with the invasion and mestastasis of ovarian serous carcinomas.The expressions of Caveolin-1 can be a indication of diagnosis and prognosis in ovarian serous carcinomas.

Ovarian serous carcinomas;Caveolin-1;Invasion andmestastasis

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2014-09-20本文編輯：任念）

河北省廊坊市科學技術研究與發(fā)展計劃項目（編號2011013026）。

朱慧芳（1973-），女，副教授，副主任醫(yī)師；研究方向：婦產科學和腫瘤病理。