植物線蟲分子鑒定研究進(jìn)展

卓 侃, 廖金鈴,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物線蟲研究室,廣州 510642;2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,廣州 510520)

植物線蟲分子鑒定研究進(jìn)展

卓 侃1, 廖金鈴1,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物線蟲研究室,廣州 510642;2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,廣州 510520)

植物線蟲可危害農(nóng)作物和林木,對(duì)它們的準(zhǔn)確鑒定是防治植物線蟲病害的基礎(chǔ)。由于植物線蟲很小,而且在形態(tài)上種間常有覆蓋,而種內(nèi)有較大的變異,僅依據(jù)形態(tài)特征很難鑒定。分子鑒定技術(shù)給植物線蟲的檢測(cè)和鑒定提供了快速、精確、可靠的方法。文章綜述了植物線蟲分子的DNA提取、分子鑒定靶標(biāo)序列的選擇及分子鑒定方法等方面的研究進(jìn)展及現(xiàn)狀,以促進(jìn)對(duì)植物線蟲分子鑒定更深入的研究。

植物線蟲; 分子鑒定; DNA; PCR

線蟲動(dòng)物門是動(dòng)物界中最大的門之一,線蟲數(shù)量龐大,種類繁多,生活方式多樣。其中,有許多種類是寄生植物的,這些線蟲稱為植物線蟲。目前,正式報(bào)道了約4 100種植物線蟲[1],它們已成為危害農(nóng)林生產(chǎn)和食品安全的一個(gè)重要因素[2]。據(jù)估計(jì),每年因植物線蟲的危害可導(dǎo)致800億美元的損失[3],因此植物線蟲的防治已成為生產(chǎn)上的一項(xiàng)重要工作?？咕€蟲植物品種的選擇和作物輪作的方法是防治植物線蟲的重要手段,這些方法的應(yīng)用是建立在植物線蟲準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上。另外,由于不同線蟲對(duì)殺線蟲劑敏感性可能不同,或某些線蟲對(duì)某些藥劑會(huì)產(chǎn)生抗藥性,所以在使用化學(xué)防治前,最好也要了解清楚植物線蟲的種類。人們一般是依據(jù)形態(tài)對(duì)植物線蟲進(jìn)行鑒定。然而,植物線蟲非常小,體長一般在0.3～2 mm[4],而且通常植物線蟲種間形態(tài)有覆蓋,而種內(nèi)卻有較大的變異,這給人們鑒定帶來很大的困難。近年來,隨著一些線蟲分類學(xué)家的退休,同時(shí)年輕的科研工作者對(duì)線蟲形態(tài)分類的興趣逐漸減弱,專業(yè)從事線蟲形態(tài)分類鑒定的科研工作者越來越少[5]。因此,迫切要求一些新的線蟲鑒定技術(shù)的發(fā)明和使用。

同工酶電泳技術(shù)是鑒定植物線蟲的方法之一。通常,種內(nèi)的酶譜帶一致,而種間則有不同,通過分析譜帶類型即可進(jìn)行種的判定。該技術(shù)最早在20世紀(jì)70年代初應(yīng)用于幾種常見根結(jié)線蟲(Meloidogyne sp p.)的鑒定[6]。雖然該技術(shù)在其他一些線蟲,如大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)、三形莖線蟲(Ditylenchus triformis)和燕麥真滑刃線蟲(Aphelenchus avenae)上也有過研究[6],但目前同工酶譜分析只有在根結(jié)線蟲中得到較好的應(yīng)用。究其原因,主要是由于某些蛋白只能在線蟲特定的階段才會(huì)表達(dá),因此同工酶的提取對(duì)蟲態(tài)有嚴(yán)格的要求,一般只能選用年輕的雌蟲。除了根結(jié)線蟲,其他植物線蟲的年輕雌蟲相對(duì)較難獲得。然而,線蟲的DNA通常不會(huì)隨著線蟲蟲態(tài)或環(huán)境的變化而出現(xiàn)變化,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基于DNA的線蟲鑒定技術(shù)得到迅速發(fā)展。本文綜合國內(nèi)外大量文獻(xiàn)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果對(duì)植物線蟲分子鑒定技術(shù)的進(jìn)展和研究近況進(jìn)行概括和綜述,以期為我國植物線蟲分子鑒定技術(shù)研究提供參考信息。

1 DNA的提取

分子鑒定的第一步是線蟲模板DNA的準(zhǔn)備。植物線蟲DNA的提取方法目前已經(jīng)比較成熟。早期通常對(duì)大量的活體線蟲進(jìn)行DNA提取,采用的方法一般是常規(guī)的酚氯仿抽提法[7]。然而,由于大多數(shù)植物線蟲難以進(jìn)行大量純化培養(yǎng),且從自然界中分離到的線蟲經(jīng)常為混合種群,因此少量線蟲,特別是單條線蟲的DNA提取越來越受到人們的重視。通常通過蟲體的裂解、蛋白酶K處理及短暫的高溫處理等步驟即可獲得可進(jìn)一步用于PCR的單條線蟲DNA[8- 12]。

上述線蟲的DNA提取首先要將線蟲從土壤或病組織中分離出來,需要花費(fèi)一定的時(shí)間。為了加快線蟲的檢測(cè)速度,近年人們研究了直接從含線蟲的土壤或病組織中提取DNA,只要該模板中含有少量靶標(biāo)線蟲的DNA,就可以通過進(jìn)一步的PCR將靶標(biāo)線蟲檢測(cè)出來。該方法最大的限制因素是從土壤或植物組織中抽提的DNA中會(huì)存在多種抑制因子,如腐殖酸、酚類化合物、蛋白和多糖等[1314],這些抑制因子可能會(huì)影響下一步的PCR。然而,目前隨著DNA提取方法和試劑的不斷改進(jìn),這些抑制因子的影響已基本可以被克服,越來越多的成功例子被報(bào)道。例如：Atkins等[15]利用土壤DNA提取試劑盒直接提取含假根結(jié)線蟲(Nacobbus)的土壤總DNA,并利用PCR方法成功地從該模板中檢測(cè)到假根結(jié)線蟲;Yan等[16]提取含落選短體線蟲(Pratylenchus neglectus)和桑尼短體線蟲(P.thornei)的土壤DNA,并用PVP柱純化該DNA,最后成功地檢測(cè)到這兩種短體線蟲;Min等[17]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從含南方根結(jié)線蟲(M.incognita)的沙壤土DNA中檢測(cè)到南方根結(jié)線蟲;Sayed Abdul Rahman等[14]提取了含根結(jié)線蟲的香蕉根DNA,并用PCR方法從中檢測(cè)到根結(jié)線蟲;Hu等[18]提取了單個(gè)根結(jié)的DNA,并利用多重PCR的方法從單個(gè)根結(jié)DNA中成功地鑒定了南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica);Peng等[19]提取了被相似穿孔線蟲(Radopholus similis)侵染的香蕉、紅掌和柑橘的根DNA,并利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)從這些DNA中成功檢測(cè)到相似穿孔線蟲。

植物線蟲的DNA除了可以從活體線蟲中提取,也可以從一些固定的標(biāo)本中提取。一些研究表明可以從保存在福爾馬林或甘油中幾天甚至幾年的線蟲標(biāo)本中提取DNA[20-23]。Rubtsova等[23]甚至報(bào)道從固定超過10年的長針線蟲(Longidorus sp.)中提取出DNA,并以此DNA為模板,準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增了28S r RNA的D2區(qū)序列。從固定的線蟲標(biāo)本中提取DNA,對(duì)人們分析一些稀有種類具有較大的幫助。

2 DNA靶標(biāo)序列的選擇

理想的用于鑒定物種的DNA靶標(biāo)序列通常是在種內(nèi)保守,而在種間變異大,并容易被擴(kuò)增。在植物線蟲中,核糖體DNA(r DNA)是最常用來做鑒定的靶標(biāo)序列,r DNA是線蟲中最早被鑒定的序列之一,且該區(qū)段是多拷貝序列,容易擴(kuò)增。其中,核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)是使用最多的區(qū)段[24-26]。ITS可以很好地用于一些植物線蟲屬下種的區(qū)分和鑒定,比如傘滑刃線蟲屬(Bursaphelenchus)、孢囊線蟲屬(Heterodera)、莖線蟲屬(Ditylenchus)、半穿刺線蟲屬(Tylenchulus)和隱皮線蟲屬(Cryphodera)等[27-31]。然而,ITS序列也不是在所有植物線蟲屬中均可用來區(qū)分種。在根結(jié)線蟲屬中,幾個(gè)常見的種如南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria),它們彼此之間的ITS序列非常保守[7,24,32],根本無法用ITS序列來區(qū)分。而在短體線蟲屬中,ITS序列在一些種內(nèi)變異很大[33-35],例如玉米短體線蟲(P.zeae)和落選短體線蟲種內(nèi)變異分別達(dá)到8%和6%,明顯高于短體線蟲咖啡物種復(fù)合體的種間差異,因此單用ITS序列來鑒定短體線蟲有時(shí)可能會(huì)出錯(cuò)。除了ITS,r DNA中的18S r RNA基因和28S r RNA基因中的D2D3區(qū)也在植物線蟲的分類鑒定中有較廣范的使用。相對(duì)于ITS,18S r RNA和28S r RNA更為保守,因此它們?cè)趨^(qū)分屬或?qū)偕戏诸愲A元時(shí)可能更為好用。當(dāng)然,在某些墊刃類線蟲或長針類線蟲中,D2D3也可以用來區(qū)分種[36-37]。另外,r DNA中的間隔基因區(qū)(IGS)也在少數(shù)植物線蟲種的鑒定中被使用,如Petersen和Vrain[38]依靠IGS序列鑒定了3個(gè)在歐洲重要的根結(jié)線蟲種。

線粒體DNA(mt DNA)是許多動(dòng)物分類鑒定的重要靶標(biāo),尤其是mtDNA的CO I基因。mtDNA作為植物線蟲鑒定的分子靶標(biāo)的研究相對(duì)起步較晚,也較少。目前,COⅡ/rrn L之間的序列在一些根結(jié)線蟲種的鑒定方面起到重要的作用[11,3941]。此外, CO I基因也被用來分析傘滑刃線蟲屬松材組和劍線蟲屬(Xiphinema)美洲組線蟲的系統(tǒng)發(fā)育[4243]。

除了r DNA和mt DNA,其他一些看家基因甚至效應(yīng)蛋白基因也被嘗試用來鑒定植物線蟲。例如：主要精子蛋白基因(major sperm protein,msp)被用來區(qū)分穿刺短體線蟲(P.penetrans)和斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)[44];熱激蛋白90基因(Hsp 90)被用來區(qū)分和研究一些根結(jié)線蟲、孢囊線蟲和短體線蟲的系統(tǒng)關(guān)系[45];肌動(dòng)蛋白基因(actin)被用來區(qū)分孢囊線蟲屬、球孢囊線蟲屬(Globodera)和根結(jié)線蟲屬[46];一個(gè)分支酸變位酶(chorismate mutase)基因被用來區(qū)分幾個(gè)球孢囊線蟲[47];β-1,4-內(nèi)切葡聚糖基因(β-1,4-endoglucanase gene)被用來鑒定桑尼短體線蟲[48]。這些基因在植物線蟲的鑒定中是否能發(fā)揮更重要的作用有待今后更多的研究驗(yàn)證。

3 分子鑒定技術(shù)與方法

植物線蟲分子鑒定的技術(shù)方法不少,大多數(shù)是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。比如基于多態(tài)性分析的一些分子標(biāo)記方法：包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)。另外像PCR后測(cè)序比對(duì)、利用特異性引物擴(kuò)增、qPCR等技術(shù)是近年來應(yīng)用較多的技術(shù)。此外,還有一些具有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?如DNA微陣列雜交技術(shù)。下面介紹幾種在植物線蟲鑒定中目前應(yīng)用較多、比較重要的方法。

3.1 PCR-RFLP

RFLP技術(shù)是利用DNA的特定序列能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割的特點(diǎn),用限制性內(nèi)切酶去切割不同物種的DNA,由于不同物種的核苷酸序列不同,酶切后會(huì)產(chǎn)生不同大小與數(shù)量的片段,再通過電泳進(jìn)行判斷。早期人們用限制性內(nèi)切酶直接酶切植物線蟲的總DNA,如Curran等[49]用Eco RⅠ對(duì)4種常見的根結(jié)線蟲總DNA進(jìn)行酶切。雖然不同種的DNA酶切片段會(huì)不同,但由于總DNA太大,酶切出來的片段一般也大,而且多,導(dǎo)致這些片段在電泳膠上密集出現(xiàn)而連成一片,很難辨別,往往需要進(jìn)一步的Southern印跡雜交才有可能判斷,因此不利于鑒定。鑒于此,后來人們先用通用引物去擴(kuò)增不同物種的同一個(gè)分子區(qū)段,然后再用限制性內(nèi)切酶去酶切該區(qū)段,就可以通過電泳獲得清晰的RFLP圖譜。通常同一物種RFLP圖譜相同,而不同種則不同。在植物線蟲中,較多的是先擴(kuò)增ITS區(qū),然后用5～6種限制性內(nèi)切酶對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行酶切,獲得各個(gè)種的ITS-RFLP圖譜?，F(xiàn)在超過50種的傘滑刃線蟲屬線蟲和超過45種的孢囊線蟲屬線蟲已建立了ITS-RFLP圖譜[50-51],RFLP圖譜已成為這些線蟲鑒定的一個(gè)重要依據(jù)。在根結(jié)線蟲中,RFLP方法可以很好地區(qū)分南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。用引物對(duì)C2F3和1108先擴(kuò)增COⅡ/rrn L之間的序列,兩者均產(chǎn)生大約1.7 kb的序列,再用Hin f I進(jìn)行酶切,南方根結(jié)線蟲可以產(chǎn)生1.4 kb和0.3 kb兩條帶,而爪哇根結(jié)線蟲則不能被酶切[39]。然而,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)植物線蟲r DNA-ITS和mt DNA存在異質(zhì)性,即種內(nèi)不同個(gè)體間甚至個(gè)體內(nèi)部在相同區(qū)段存在DNA序列的變異,如果恰好在選用的酶切位點(diǎn)處發(fā)生變異,就會(huì)導(dǎo)致PCR-RFLP圖譜產(chǎn)生種內(nèi)差異[51-52]。例如,在孢囊線蟲屬中,至少已發(fā)現(xiàn)6種孢囊線蟲存在ITS異質(zhì)性而使某種酶的酶切譜帶出現(xiàn)2種或2種以上的現(xiàn)象[28,51]。因此,使用RFLP技術(shù)鑒定植物線蟲種需要注意序列異質(zhì)性的問題。

3.2 測(cè)序比對(duì)

直接測(cè)序比對(duì)的方法是鑒定物種的一個(gè)有效方法。在植物線蟲中,通常擴(kuò)增r DNA的ITS或D2D3序列,或mt DNA的CO I或COⅡ等基因,然后進(jìn)行測(cè)序,再在Gen Bank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。1993年,Ferris等[53]最早對(duì)孢囊線蟲的ITS區(qū)進(jìn)行了測(cè)序。目前,越來越多的植物線蟲鑒定靶標(biāo)序列被測(cè)定并儲(chǔ)存在GenBank中,而且測(cè)序費(fèi)用也在不斷下降,因此直接測(cè)序比對(duì)的方法已在植物線蟲鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用,該方法必然是今后植物線蟲鑒定的最重要手段之一。

3.3 基于物種特異性引物的PCR擴(kuò)增

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,獲得了越來越多的植物線蟲序列。通過序列的比對(duì),人們可以設(shè)計(jì)出特異性引物來擴(kuò)增靶標(biāo)線蟲的靶標(biāo)序列,然后通過電泳比較擴(kuò)增條帶的有無及大小即可鑒定靶標(biāo)線蟲。當(dāng)然,有一些特異性引物是從早期的多態(tài)性分析分子標(biāo)記技術(shù),如RAPD技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展來的,我們通常稱之為序列特異性擴(kuò)增區(qū)(sequence characterized amplified region,SCAR)標(biāo)記。換言之, SCAR標(biāo)記就是將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序,根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物,對(duì)基因DNA片段再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增。一個(gè)好的SCAR標(biāo)記可以快速檢測(cè)大量個(gè)體,結(jié)果穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性高,比如Zijlstra和Donkers-Venne[54]在RAPD基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的用來區(qū)分3種常見根結(jié)線蟲(南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲)的SCAR標(biāo)記(Finc/Rinc、Fjav/Rjav和Far/Rar)一直受到人們的青睞及使用。相對(duì)于測(cè)序比對(duì),利用特異性引物的PCR擴(kuò)增(或稱特異性PCR擴(kuò)增)方法更快速、簡單、直觀,因此得到廣泛的應(yīng)用。鑒定孢囊線蟲、根結(jié)線蟲和短體線蟲的一些物種特異性引物可參考幾本專著[28,5556]。

在特異性PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上發(fā)展起來的雙重PCR(duplex PCR)或多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)也是植物線蟲鑒定的一種重要方法。雙重PCR或多重PCR是利用兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物在單個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段,以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種的目的。多重PCR的概念是在1988年提出的[57],此后被廣泛應(yīng)用在物種的鑒定上。該技術(shù)也不斷被用于植物線蟲的檢測(cè)和鑒定,比如對(duì)一些常見根結(jié)線蟲種的鑒定,Hu等[18]用4對(duì)引物同時(shí)鑒定南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲;Kiewnick等[58]同時(shí)使用3對(duì)引物鑒定3種常見的根結(jié)線蟲——南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲。另外對(duì)松材線蟲(B.x ylophilus)及其近似種的區(qū)分和鑒定,如Jiang等[59]用2對(duì)引物鑒定松材線蟲;Zhuo等[60]用5條引物同時(shí)鑒定3種松材組線蟲——松材線蟲、擬松材線蟲(B.mucronatus)和豆傘滑刃線蟲(B.doui)。還有對(duì)短體線蟲一些近似種的區(qū)分和鑒定,如Wang等[61]用2對(duì)引物區(qū)分甘蔗上的兩個(gè)近似種——擬玉米短體線蟲(P.parazeae)和玉米短體線蟲(P.zeae)。多重PCR可以加快檢測(cè)的速度,但如果在一個(gè)反應(yīng)體系中存在一對(duì)以上的引物,那引物相互間可能會(huì)互相干擾,導(dǎo)致PCR反應(yīng)體系不穩(wěn)定,因此多重PCR反應(yīng)體系通常需要花費(fèi)較多的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[62]。

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后還可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與傳統(tǒng)PCR相比,qPCR反應(yīng)更快、更靈敏,可對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),另外不僅可定性,還可定量。因此,該技術(shù)從發(fā)明以來,在臨床疾病診斷和植物病害診斷等領(lǐng)域得到快速發(fā)展。qPCR在植物線蟲的檢測(cè)中,通常有SYBR GreenⅠ法和Taq Man探針法。由于qPCR整個(gè)檢測(cè)過程通常只需要0.5～2 h,因此其在檢疫部門得到廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外有大量的研究報(bào)道利用qPCR技術(shù)檢測(cè)松材線蟲[63-67]。另外,一些重要的植物病原線蟲,如馬鈴薯白線蟲(G.pallida)和甜菜孢囊線蟲(H. schachtii)[68]、馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis)和南方根結(jié)線蟲[69]等,也有用qPCR進(jìn)行快速檢測(cè)的報(bào)道。結(jié)合多重PCR技術(shù),人們還發(fā)明了多重qPCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)幾種線蟲,例如在一個(gè)qPCR體系中同時(shí)檢測(cè)哥倫比亞根結(jié)線蟲(M.chitwoodi)和偽根結(jié)線蟲(M.fallax)[70]及同時(shí)檢測(cè)3種球孢囊線蟲——馬鈴薯金線蟲、馬鈴薯白線蟲和煙草球孢囊線蟲(G.tabacum)[71]。

此外,我們還可利用qPCR測(cè)定土壤中的線蟲密度。由于qPCR反應(yīng)中切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量,從而計(jì)算出線蟲的數(shù)量。近年來,該方法在土壤線蟲的定量研究中越來越受到重視,如Yan等對(duì)土壤中落選短體線蟲和桑尼短體線蟲的定量[16,72];宋志強(qiáng)等對(duì)土壤中南方根結(jié)線蟲的定量[73]。

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是于2000年發(fā)明的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)[74]。該技術(shù)能在60～65℃的等溫條件下,短時(shí)間(一般不超過1 h)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增;使用一對(duì)外部引物和一對(duì)內(nèi)部引物,識(shí)別靶標(biāo)序列上6個(gè)不同的區(qū)域,因此對(duì)靶標(biāo)序列具有高度的特異性;擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法多樣,除了可電泳檢測(cè),也可在反應(yīng)體系中加入染料,根據(jù)顏色的變化直接用肉眼觀察,還可利用濁度儀檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的混濁度。與傳統(tǒng)PCR相比,LAMP不需要昂貴的PCR儀,也不需要跑電泳,因此具有簡便、快速、精確、特異和低價(jià)的特點(diǎn)。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于病原物的檢測(cè),在植物病原真菌和細(xì)菌的檢測(cè)方面已有一些應(yīng)用[7576]。在植物線蟲學(xué)領(lǐng)域,近年來也有一些成功的例子,包括對(duì)松材線蟲、根結(jié)線蟲和相似穿孔線蟲的檢測(cè)[19,7779]?？偟膩砜?LAMP技術(shù)是一個(gè)相對(duì)比較新且具有一定實(shí)用性的分子檢測(cè)技術(shù)。目前LAMP技術(shù)在植物線蟲領(lǐng)域應(yīng)用還較少,值得今后進(jìn)一步研究。

4 DNA條形碼

DNA條形碼(DNA barcoding)是一個(gè)相對(duì)較新的概念,是2003年Hebert提出來的,即利用一段短的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列作為標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的物種鑒定,就像超市利用條形碼掃描區(qū)分成千上萬種不同的商品[80]。通常拿來作條形碼的DNA片段需要滿足幾個(gè)條件：(1)在種間有足夠的差異;(2)不要太長,以便擴(kuò)增;(3)兩端序列保守,容易設(shè)計(jì)通用引物[81]。mt DNA比r DNA進(jìn)化更快,有足夠的差異去區(qū)分近緣種,其中mtCO I基因大約為650 bp,較好地符合上述條件,因此常被當(dāng)做動(dòng)物鑒定的條形碼[80,82-84]。在線蟲中,已有研究發(fā)現(xiàn)mtCO I基因可以作為海洋自由生活線蟲的DNA條形碼[85],然而植物線蟲的mtDNA研究還很少。在植物線蟲中研究較多的幾個(gè)r DNA片段,如ITS、D2D3和18S r RNA,有的在一些植物線蟲屬中變異太大,有的又太保守,Subbotin等[86]認(rèn)為種內(nèi)變異、旁系同源拷貝或無法區(qū)分最近形成的物種等因素部分限制了r DNA的使用。因此,不同的植物線蟲類群也許需要不同的DNA條形碼,或者需要多個(gè)基因片段作為條形碼。總之,植物線蟲的DNA條形碼研究才剛起步,需要獲得更多的序列以便更深入的研究。

5 問題與展望

植物線蟲分子鑒定起步相對(duì)較晚,目前已經(jīng)獲得序列的植物線蟲種類還較少,因此當(dāng)前還不可能完全依賴分子手段來對(duì)植物線蟲進(jìn)行鑒定。此外,根據(jù)目前的研究,在植物線蟲鑒定中常用的r DNAITS序列在某些線蟲中變異大[33-35],而在某些線蟲中又很保守[7,24,32],因此針對(duì)不同的線蟲類群,需要在研究足夠多序列的前提下,了解清楚序列的種內(nèi)變異及種間變異的范圍,才能更好地選擇合適的鑒定靶標(biāo)。當(dāng)前,分子手段已經(jīng)給植物線蟲的檢測(cè)和鑒定提供了快速、精確、可靠的方法。尤其對(duì)一些生產(chǎn)上重要種類的快速檢測(cè),以及區(qū)分一些形態(tài)上十分相似的近緣種,分子鑒定給我們帶來了極大的幫助。近年在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上,結(jié)合分子手段鑒定了一些僅從形態(tài)上不好確定的新種,如與鱗球莖線蟲(D.dipsaci)形態(tài)相似的巨大莖線蟲(D.gigas)[29],與咖啡短體線蟲(P.coffeae)形態(tài)基本難以區(qū)分的斯派吉爾短體線蟲(P.speijeri)[87],與玉米短體線蟲形態(tài)相近的擬玉米短體線蟲[61]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及更多的植物線蟲序列被測(cè)定,可能會(huì)有更簡單、方便、可靠的分子鑒定方法被發(fā)明。不論是現(xiàn)在,還是將來,分子鑒定方法都是植物線蟲鑒定的一個(gè)有力工具。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Advances in molecular identification of plant nematodes

Zhuo Kan1, Liao Jinling1,2

(1.Laboratory of Plant Nematology,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Vocational College of Ecological Engineering,Guangzhou 510520,China)

Plant nematodes can damage crops and trees.The accurate identification of plant nematodes is the basis for the control of plant nematode diseases.It is very challenging to identify plant nematode species only based on morphology,because plant nematodes are microscopic in size,and some morphological characters may have interspecific overlapping or intraspecific variability.Molecular techniques provide a fast,accurate and reliable method for the detection and identification of plant nematodes.For promoting the deep study on molecular identification of plant nematodes,this paper summarized research progresses in and current research status on DNA extraction of plant nematodes,target sequences for identifying plant nematodes and the main molecular identification methods for plant nematodes.

plant nematode; molecular identification; DNA; PCR

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.001

2014-10-06

2014-10-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103018)

*通信作者 E-mail：jlliao@scau.edu.cn