大鼠表皮干細胞分離培養的方法研究

摘要：目的是探討大鼠表皮干細胞的分離培養的方法。方法主要以0 ～7日齡SD大鼠為材料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分離表皮細胞，IV型膠原黏附法對分離的表皮干細胞進行培養，觀察其形態、生長情況。結果是培養后的表皮干細胞胞質近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀。結論為該方法分離培養的表皮干細胞純合，呈現典型的上皮型細胞形態，可用于皮膚的再生修復。

關鍵詞：表皮干細胞；細胞分離；細胞培養

中圖分類號： Q593. 2 文獻標識碼： A 文章編號： 1674-0432（2014）-18-17-1

表皮干細胞也可稱角質干細胞，不同部位的表皮干細胞分布存在差異，其主要分布于表皮基底層和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺邊緣[1]。表皮干細胞在維持皮膚的自我更新、創傷修復、皮膚腫瘤的發生等方面扮演著重要的角色，因此成功地分離、培養表皮干細胞對臨床上創傷修復、皮膚癌的研究起著至關重要的作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及用具

1.1.1實驗材料 0～7日齡SD大鼠。

1.1.2實驗試劑 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型膠原，DMEM培養液，D-Hanks，KSFM培養液，凍存液，75%酒精。

1.1.3實驗用具 剪刀、鑷子、尼龍紗網、手術刀、培養瓶、培養皿、凍存管、水浴鍋、CO2培養箱、超凈工作臺，電子顯微鏡，離心機等。

1.2 實驗方法

1.2.1表皮細胞的分離 取0 ～7日齡SD大鼠，脫頸錐處死， 75%酒精清洗，剪取背部皮膚，D-Hanks清洗，將其切割為0.5×1.0厘米的皮膚組織，0.25%中性蛋白酶在4℃處理12～16小時，吸棄上清液，D-Hanks清洗后分離表皮和真皮。表皮剪碎呈糜狀，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃條件下消化5～10分鐘，用含小牛血清的DMEM培養液終止消化，吹打至懸液，100目尼龍紗網過濾，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液，以培養液重懸制成單細胞懸液。

1.2.2 膠原黏附法選擇表皮干細胞 將單細胞懸液以2×105 個/毫升的密度接種在鋪被IV型膠原的培養瓶內，37℃、5%CO2培養箱中孵育10～15分鐘。吸出細胞懸液，粘附在膠原被膜上的細胞則為表皮干細胞。

1.2.3 表皮干細胞培養 在去除細胞懸液鋪被IV型膠原的培養瓶中加入無血清角質形成細胞培養基（KSFM）進行培養，12小時后換液以除去未貼壁的細胞，以后每2天換液一次，光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2 結果與分析

2.1 原代培養的表皮干細胞

剛剛接種的表皮干細胞，細胞均勻分散呈圓形，核大，胞體小，培養一周（圖1）進入增殖期，第12天達到高峰表皮干細胞漸漸伸展形成扁平的多角狀，胞質近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀，匯合成片。

2.2 傳代培養的表皮干細胞

原代細胞接種24小時后即伸展，相互聚集，粘附在膠原上，呈克隆樣生長，細胞聚集在集落中心周圍呈輻射狀生長，5～6天表皮干細胞增殖能力加強，達到融合鋪滿培養瓶的瓶底。

3 結語

不同的細胞外基質對細胞的黏附作用不同，表皮干細胞主要通過表達整合素實現其對基底膜的粘附，同時也是干細胞維持其特性的基本條件。IV型膠原作為細胞外基質的主要成分對細胞的粘附、生長、移行等方面起重要作用，表皮干細胞不僅對IV型膠原有較強的粘附性，而且在IV型膠原上能很好的生長，由此進行篩選、培養、純化表皮干細胞，結果表明，獲得的表皮干細胞較純凈，其仍具有較強的分裂增殖能力，于培養后第二天，大量克隆細胞形成，5～6天匯合成片，可以長期傳代。該方法操作簡便，表皮干細胞生長良好，具有較高的克隆形成率。

無血清培養基及其附加的營養成分在細胞生長與培養液之間提供了較好的平衡體系，有利于表皮干細胞的增殖及其表型的維持，由于培養基中不含血清，沒有血清中的各種復雜和不明的成分，排除血清中許多未知因素對干細胞分化的影響，是目前培養表皮干細胞被認可的方法[3]。

參考文獻

[1] 孫曉燕，付小兵，孫同柱.表皮干細胞的分離培養和鑒定，中華實驗外科雜志[J]，2007，24（2）：163-164.

[2] 王海燕.肺出血·腎炎綜合征抗基底膜抗體型.北京人民衛生出版社[M]，1998：912-922.

[3] 劉德伍，陳國安，曹勇，等.人表皮細胞無血清培養的實驗研究[J]，1997，13（6）：419-420.

作者簡介：馮穎，碩士學歷，通化師范學院生命科學學院，講師，研究方向：生物技術。