細菌與生物材料黏附特性的相關研究

張瑞斐，黃迅悟

解放軍第三〇九醫院全軍骨科中心 關節外科，北京 100091

細菌與生物材料黏附特性的相關研究

張瑞斐，黃迅悟

解放軍第三〇九醫院全軍骨科中心 關節外科，北京 100091

細菌黏附是一個復雜過程，受多種因素影響。隨著醫學生物材料應用增多，感染發病率也明顯增高，如何防治生物材料相關感染是臨床急需解決的問題。因此，研究細菌與生物材料黏附對于探討生物材料植入機體引起的感染具有重要意義。本綜述簡單介紹了生物材料中有關細菌黏附機制，著重分析了細菌黏附影響因素，以及細菌自身特性、宿主因素對細菌黏附的影響，并在總結細菌黏附研究中所存在問題的基礎上，對未來研究的發展趨勢提出展望。

生物材料；細菌黏附；生物膜

細菌黏附及其意義的研究可以涵蓋人類生活的不同方面。隨著生物材料應用增多，相關感染發病率也明顯增高，防治生物材料相關感染是臨床亟需解決的問題[1]。細菌附著在人體組織和植入的生物材料表面是感染發病機制中一個重要環節[2]。因此, 研究生物材料細菌黏附對于探討生物材料植入機體引起的感染具有重要意義, 阻斷細菌黏附是防治與生物材料相關感染的關鍵環節[3]。本文主要介紹了生物材料中有關細菌黏附特性的相關研究。

一般來說，兩種物質之間表面力相互作用結果稱為黏附。在黏附過程中，細菌在植入物表面分泌一層粘液，抵御來自宿主的免疫反應，降低其對抗生素的敏感性[3]。細菌產生的細胞外物質（胞外聚合物主要由多糖組成）可保護細菌減少抗生素的殺滅。細菌如不能產生細胞外物質往往致病力較弱。細菌可以在材料表面停留很長一段時間[4]。一旦宿主的免疫活性降低，即在假體周圍的組織中生長。

1 細菌黏附機制

細菌黏附在生物材料表面及臨近組織是引起感染的起始動因。細菌在材料表面黏附可分為兩個階段：①初期可逆物理相階段；②時間依賴性不可逆分子和細胞階段[4]。從物理化學的角度來看，非特異性相互作用力可以導致細菌黏附，當局部表面的相互距離＜5 nm時，物質間的相互作用力利于細菌黏附。生物材料表面的細菌黏附，特異性和非特異性相互作用可能發揮著重要作用[5]。

（1）第1階段：細菌和材料表面之間物理化學方面的相互作用。細菌通過物質間的相互吸引力附著在材料表面上，隨后吸附在材料表面上[5]。這種相互作用力的影響包括：布朗運動、范德華力、引力、表面靜電和疏水作用。可進一步劃分為長程和短程相互作用。當兩者相距50 nm時的相互作用力稱為長程相互作用力，這種作用力是非特異性的。短程相互作用是指相互距離到達5 nm時，離子相相互作用、偶極相互作用以及疏水相互作用[5]。細菌通過長程相互作用到達材料表面后，短程相互作用變得更加重要。

（2）第2階段：細菌和材料表面，分子和細胞之間的相互作用。在第2階段的黏附中，主要是細菌和材料表面分子間的特異性反應[6]。細菌通過表面的聚合物結構，選擇性黏附到材料表面使黏附更加穩固。第2個階段中，某些細菌能夠形成生物膜。生物膜的形成過程中，細菌分泌的胞外多糖層能保留營養成分和耐受宿主的免疫應答。

2 細菌黏附影響因素

細菌黏附是極其復雜的過程，受多種因素影響，包括環境因素（如血清中存在蛋白質或抗生素）、抗菌性能和材料表面特性[7-8]。細菌在黏附過程中通過改變材料表面特性和相關環境，從而達到穩固的黏附。

2.1 環境因素

環境因素是指一般環境中的某些因素，如溫度、曝光時間、細菌濃度、化學處理、抗生素和水流條件等[7-8]。

水流條件能明顯減少細菌黏附，對附著細菌的數量、生物膜結構和性能有重要影響[10]。Katsikogianni等[9]對一些能影響細菌黏附的底物研究，發現剪切速率從150/s至1500/s時，附著的細菌數量顯著減少。其中，類金剛石薄膜的表現與其他材料不同，主要原因是其具有較高的表面粗糙度值。高粗糙度值能提高細菌的表面接觸面積，使細菌優先附著于粗糙表面，保護自己免受剪切力的影響。Katsikogianni等[9]在另一項研究中發現，表皮葡萄球菌的兩個菌株，剪切速率從50/s增至500/s或1000/s，特別是當到達2000/s時，黏附反而增加。一般認為，隨著剪切速率增加，附著的細菌數量隨之減少，然而兩者之間存在一種平衡。Mohamed等[11]研究發現，存在較多金黃色葡萄球菌受體的膠原蛋白涂層蓋玻片，當剪切速率由50/s增至300/s時，細菌黏附增加。剪切速率在超過500/s時黏附下降。當蓋玻片細胞受體較少的情況下，流速對黏附的影響并不明確。

電解質的濃度，如氯化鉀、氯化鈉和pH值也會影響細菌的附著。pH值的變化可以顯著影響細菌的生長和黏附[7-8]。細菌能通過膜結合質子泵擠出質子調節自己的胞質pH值，并形成跨膜電化學梯度。細菌通過自身調節能適應小幅度的pH值變化[12]。有研究表明，培養基中緩慢加入HCl與快速加入HCl相比，能增加細菌的存活率。Hamadi等[12]觀察pH值變化對金黃色葡萄球菌ATCC25923黏附性的研究，應用掃描電鏡發現，金黃色葡萄球菌ATCC25923的黏附依賴于懸浮介質的pH值。在高度酸性（pH為2～3）或堿性條件下，易于細胞黏附；當pH為5為時黏附減少。Kinnari等[13]對矯形外科內植物感染中最常見的致病菌，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌進行體外模擬研究發現，當pH值從7.4下降至6.8時，葡萄球菌在HA和BCP兩種材料表面附著顯著下降。材料表面pH值降低時能減少細菌感染。

2.2 抗菌藥物

抗生素對細菌黏附的影響，取決于細菌的易感性和抗生素濃度[8]。Kohnen等[14]研究發現利福平、司帕沙星能減少結核分枝桿菌在材料表面的黏附。Stigter等[15]研發出一種植入鈣含磷酸酯的仿生鈦合金涂層Ti6Al4V，該涂層能以濃度依賴的方式，有效對抗金黃色葡萄球菌生長。但是，生物膜中的細菌有別于浮動的細菌。胞外聚合物能將營養成分和礦物質引導到生物膜內部，同時免受有害物質的影響。生物膜對抗生素耐藥有三個機制：胞外聚合物質能減少抗生素的滲透、造成有利的內部環境（例如厭氧）和對細菌細胞分化提供更好的保護。即使抗生素對寄生菌的治療有效，仍會有部分細菌存活。Prado等[16]對懸浮肺炎鏈球菌及其生物膜對抗生素的易感性進行評估發現，抗生素治療對細菌黏附的抑制效果大于對生物膜形成的抑制效果。因此，最佳的抗感染戰略是尋求抑制細菌生物膜的形成。無論是物理的相互作用，還是細菌或材料表面特性的變化，都可能會影響細菌的黏附[7]。

2.3 材料表面特性

材料的表面特性，包括生物材料表面化學成分、表面電荷、疏水性、表面粗糙度和物理結構等[7-8]。

材料表面的化學成分能影響細菌的黏附和繁殖，對細菌黏附的影響主要表現在材料的疏水性和表面電荷。金屬材料表面有較高的表面能、負電荷和親水性，聚合物材料有表面能低、不帶電荷和疏水性的特性[7-8]。水接觸角（WCA）能反應材料表面的親疏水性，主要由接觸角測量評估材料表面的疏水性。高WCA表現為疏水性和低WCA表現為親水性。由于細菌及材料表面的親疏水性不同，細菌黏附的情況也不同[7]，如金黃色葡萄球菌在疏水性區域利用蛋白質共價結合到細胞壁上。Katsikogianni等[9]發現類金剛石碳涂層的PVC與無涂層PVC相比，表皮葡萄球菌黏附水平較低，可能是由于表面改性導致疏水性降低所致。此外，Katsikogianni等[9]還發現氟化PVC與經過滅菌的PVC相比，表皮葡萄球菌黏附增加，可能由于PVC表面氟化后的疏水性增加所致。由于表皮葡萄球菌是一種溫和的疏水性的細菌，因此在疏水性高的氟化材料表面細菌黏附增加。

材料表面的粗糙度是通過粗糙度測量系統測得二維參數，是另一個影響細菌黏附的因素。粗糙的材料表面有利于細菌黏附及生物膜的堆積，而光滑表面不利于細菌黏附和生物膜堆積。這是由于粗糙的表面為細菌定植提供了更多機會[7-8]。Oztürk等,應用氮（N）離子表面改性的鈷鉻鉬合金和拋光涂層的鈷鉻鉬合金材料對YT - 169A表皮葡萄球菌菌株生物膜形成進行研究，結果表明表皮葡萄球菌株YT - 169A在氮（N）離子表面改性的鈷鉻鉬合金材料表面黏附多于拋光涂層，這主要歸因于材料表面的粗糙度高于拋光界面。Teughels等[17]發現表面增加粗糙度增加能促進植入物表面的生物膜形成。Katainen等[18]指出影響細菌黏附的是納米級粗糙度。納米級表面粗糙度對初始附著的細菌有重要影響，可能是由于提供的接觸點的數目所致。Webster等[19]研究鈦合金表面細菌定植時發現，表面納米粗糙度增大時細菌定植效率增加。由于臨床上不同假體表面粗糙度不同，植入體內后對細菌黏附的影響各不相同。因此，需要更多的研究來測試表面粗糙度值對細菌黏附的影響。

材料表面的物理結構相比表面粗糙度更加復雜。它是一種通過形態學描述的三維材料表面[7-8]，如單纖維界面、編織界面、多孔界面或網格狀界面等。Webster等[19]將多孔材料與無孔材料植入感染金黃色葡萄球菌的小鼠皮下，發現多孔材料相比無孔材料感染率顯著增加。這表明，細菌優先于多孔表面上黏附和定植。此外，通過掃描電鏡發現相比平滑的材料表面，細菌更易黏附在溝槽和網織材料表面，可能是由于局部的表面積增加導致[7-8]。

3 細菌自身特性對黏附影響

細菌的特點：同種材料表面，不同細菌附著所表現的理化特性也不相同。主要因為細菌自身的表面特性不同，包括細菌表面的疏水性和細菌的表面電荷的影響。

細菌表面的疏水性是影響黏附的重要物理因素。一般情況下，疏水性細菌更喜歡附著在疏水性材料表面；而親水性材料表面疏水性細菌附著相比親水性細菌少[7-8]。細菌的疏水性主要取決于菌株種類、培養基、生長時間和細菌表面結構。Walker等[20]研究發現在培養中期黏附性與疏水性相比穩定期有所降低。由于大腸桿菌細菌培養時間短，大腸桿菌外膜上親水性（酸性）的蛋白質不足，從而導致細菌表面的疏水性及黏附性降低。Kuntiya等[21]發現假單胞菌表面的疏水性隨著細胞年齡的增加逐漸降低。另外，Kuntiya等[21]發現通過添加0.5％的氯化鈉改變培養基的成分，導致細胞表面疏水性降低的更快。可能有三種原因導致疏水性的改變：①雖然機制尚不明確，但氯化鈉可以增加胞外多糖的生成。胞外多糖的主要表現為電中性和親水性，導致細菌疏水性降低；②有學者指出老化細胞的胞外多糖含量增多；③細胞在分批培養中養分缺乏會使胞外多糖生成增加，可能是導致疏水性降低的另一個原因。這些結果表明，培養基中存在氯化鈉或細胞的年齡均會影響細胞表面的疏水性。導致生物膜的形成和生長。

細菌的表面電荷可能是影響黏附的另一種重要物理因素。在介質中表面電荷能吸引反電荷的離子形成雙電荷層。大多數顆粒由于表面電荷的原因，形成電離基團懸浮在水溶液中。在水懸浮液中的細菌幾乎總是帶負電荷。細菌表面電荷的變化，主要受細菌種類、生長培養基pH值、懸浮緩沖液的離子強度、細菌年齡和細菌表面結構的影響[7-8]。

4 宿主血清和組織蛋白對黏附影響

當血液與材料接觸時首先發生蛋白的吸附。蛋白從水溶液吸附到固體表面通常分為三個步驟。首先，溶液中的運輸蛋白接近材料表面；隨后，由蛋白附著在材料表面；最后，經蛋白質構象變化吸附在材料表面[7-8]。當內植物植入宿主組織后，蛋白的細胞外基質吸附到材料表面形成蛋白層，有利于自由浮動的細菌黏附。然后附著的細菌迅速繁殖并產生粘性分泌物，最后形成致密的貼壁細胞形成生物膜。

宿主血漿蛋白對細菌黏附的影響，蛋白質可以通過改變細菌表面的理化性質改變細菌的黏附。由于材料表面吸附的蛋白不同，黏附細菌不同[7-8]。因此,血漿蛋白在細菌黏附中的作用逐漸引起重視。這些蛋白有的促進細菌黏附,也有的抑制細菌黏附，如白蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白、變性的膠原蛋白等。

纖維連接蛋白（Fibronectin，FN）能使細菌相互凝結、聚集, 增加細菌在生物材料表面的附著。多數研究表明，生物材料表面吸附FN能促進細菌的黏附[7-8]。在纖連蛋白分子中，有兩個不同的結合位點為細菌的結合點：第一個結合位點位于N末端，第二結合位點位于C-末端附近。一項研究應用等離子體共振發現在表皮葡萄球菌的C-末端片段，FN具有較高的親和力[7-8]。因此，FN在促進細菌附著到生物材料表面起到了至關重要的作用。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HAS）能吸附在如材料聚合物、陶瓷和金屬等材料表面，明顯的抑制細菌的黏附[7-8]。An等，在37℃ 下將鈦合金表面用200 mg/mL的HAS處理2小時后發現相比未處理的鈦合金，表皮葡萄球菌黏附減少95％。Kinnari等[22]在鈦表面上應用HSA涂層觀察金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌的黏附情況，發現細菌明顯比未涂層的表面黏附減少。同時還指出細菌黏附依賴于整體細菌濃度。金黃色葡萄球菌濃度由82％增至95％時，HSA涂層表面細菌黏附顯著抑制；而銅綠假單胞菌濃度由29％增至37％時受到抑制。但是，HSA的抑制作用似乎依賴于細菌菌株和物種。白蛋白對細菌黏附的抑制作用，可能是通過結合細菌從而使其親水性增加所致。然而，在最近的一項研究中，Prado等[16]研究發現溶液中HSA的濃度從40～25000 mg/mL逐漸增加時，能刺激肺炎鏈球菌菌株細菌生長。而較高濃度，則抑制細菌生長。

纖維蛋白原（Fibrinogen，FG）是另一種重要的蛋白質，通過細菌細胞膜表面特有的纖維蛋白原受體橋接于生物材料表面[23]。Ardehali等[24]通過觀察金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌在纖維蛋白原的PVC材料表面的吸附情況發現，FG-涂層的材料相比無FG涂層細菌吸附力增大5倍以上。Ardehali等[24]也報道了類似結果，在聚氨酯表面噴涂纖維蛋白原后金黃色葡萄球菌的附著力增加。這些研究表明，在纖維蛋白原存在的情況下，能介導細菌特異性的黏附到材料表面，增加細菌的黏附力。

層粘連蛋白對細菌黏附具有促進作用。有研究發現，層粘連蛋白能增加金黃色葡萄球菌和中樞神經細胞的黏附力[25]，但與FN和血纖維蛋白原的影響相比促進作用較弱[7]。也有報道稱在金黃色葡萄球菌中存在層粘連蛋白受體。

血清（Serum）在介導細菌黏附方面有一定的抑制作用。有研究表明，在生物材料處于血清中時對細菌黏附有較強的抑制作用。Baral等[25]將聚氨酯浸泡于0.5％或更高濃度的牛/人血清或血漿中觀察細菌的黏附情況，發現與對照組相比細菌黏附減少5倍以上。此外，有學者指出血清抑制細菌的附著很大程度上依賴于血清中的轉鐵蛋白。

5 結論

了解微生物與生物材料之間的相互作用，能幫助我們更好的診斷和治療內植物感染，找到抑制生物膜形成的方法或策略。應用抗菌藥物控制生物膜是一個簡單而常用的方法。許多對浮游細菌有效的抗菌藥物，對控制相同細菌生物膜的生長無效。這些抗菌藥物有不同的化學和行動模式，聯合使用多種抗菌藥物可以提高抗菌性能以及防止細菌產生耐藥性。生物膜對傳統抗生素治療的防御性，促使人們對材料的合成表面及涂層進行了大量的研究，已抵御細菌定殖。

矯形外科手術中使用的生物材料對細菌的感染敏感性不同。感染細菌的黏附和生長依賴于生物材料的表面特性，例如疏水性和表面粗糙度。因此，在開發新型的抗感染生物材料時，為影響細菌與材料表面的相互作用，必須考慮材料的表面形態和疏水性。

因此，細菌黏附是一個非常復雜的過程，受多種因素影響，需要進一步的研究，以了解細菌黏附和植入物感染的機制。提供適當的方法，以防止它們發生。未來的研究必須努力，以更好地了解內植物相關感染的發病機制，尤其是抗生素的耐藥性現象應引起重視。未來的研究應側重在感染動物模型建立和體內生物膜生長方面。

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黃迅悟，主任醫師。

通訊作者郵箱：hxw_309@163．com