乳品污染菌的基因組學研究及其在生產控制上的應用

王麗群，國立東

（1.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，哈爾濱150086；2.黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱150040）

0 引言

自乳品工業興起以來，就有了涉及乳品和乳制品的食品中毒和引發其他疾病的報道，自1972年到2000年，美國共發生58起鮮奶致病事件，每年平均約2起。乳品污染事件的“罪魁禍首”多以鮮奶中的沙門氏菌、李斯特菌以及空腸彎曲菌為主。多年來與乳中污染菌檢測、定量及鑒定等方面研究較多，目前，公開數據庫可查詢的微生物全基因組總數可達566個，不完整的基因組841個，還有許多未經記錄菌株。隨著基因組學和基因組學相關技術的發展，越來越多的基因組信息將公布于眾，此外，基因組信息學對人們認識新的細菌性狀、菌株對環境適應所產生的突變基因以及新的檢測技術的開發方面都會提供很多幫助。

1 乳中常見污染細菌及其基因組序列的研究情況

早期通過乳品傳播的疾病主要有結核、白喉和猩紅熱等，近年來的研究就主要集中在乳中傳播的多種致病性細菌和腐敗細菌上。乳及乳制品營養豐富且pH值近中性等特點為許多微生物包括病原細菌和腐敗細菌提供了良好培養基。乳中污染細菌大致可以分為三類，即人源致病菌，包括空腸彎曲桿菌、腸出血性大腸桿菌[1]、沙門氏菌屬[2]、單核細胞增生李斯特氏菌[3]、蠟樣芽孢桿菌和小腸結腸炎耶爾森（氏）菌等；能夠引起牛乳房炎的微生物，如乳房鏈球菌、人源致病菌金黃色葡萄球菌[4]和無乳鏈球菌等；還有腐敗微生物（非致病細菌）多種嗜冷菌及芽孢桿菌，如嗜冷性熒光假單胞菌[5]、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。從研究結果來看，目前許多細菌已經獲得全基因組序列，包括上述的一些人類病原菌和腐敗微生物，但是這些菌株中只有少部分測序菌株是直接分離于乳制品的。細菌基因組學的一個重要應用就是能夠對微生物安全及食品質量加以控制。

1.1 乳中人源致病菌基因組學

人源致病菌的典型測序菌株包括分離自干酪的蠟狀芽孢桿菌[6]和單核細胞增生李斯特氏菌[3,7]及分離自原料乳的高毒性空腸彎曲桿菌[8]。

蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌是在醫學和生物防御學上具有非常重要意義的一類微生物，這幾個菌株的全基因組序列也非常相近。但是，研究發現這類微生物所表現出的疾病和宿主之間的特異性往往取決于質粒，當不同菌株所含質粒的大小和數目不同時，其染色體通常會表現出很強的一致性及蛋白質相似性，甚至連基因的差異都很有限[6]。不過，在對這些菌株進行基因組學研究的基礎上，通過應用其他基因芯片和蛋白質組學等技術就能對這些菌株的一些功能性進行深入研究。

從干酪、香腸和肉制品中分離出來的三株單核細胞增生李斯特氏菌F2365、F6854和H7858的基因組得以分析，結果表明他們分別含有51、97和69個特異性基因，這些菌株及其不同的特異性基因很可能會對其病原性及其在不同環境中的生存能力產生影響。另外，與菌株F2365相比，菌株H7858和F6854的基因組序列中分別發現8603和105050個高質量的單核甘酸多態性。通過基因組的比較分析發現，三株單核細胞增生李斯特氏菌的基因組在本質上是相互聯系的，其差異主要體現在噬菌體插入位點、轉座因子和SNPs上[7]。

空腸彎曲桿菌是一種常見于人腸道內的病原菌，具有很明顯的菌株-菌株間差異性，這種差異能夠直接導致其病原潛力的差異。C.jujuni81-176因其能夠表現出獨特的病原特征并具有很強毒力而常用于實驗室研究，通過該菌株進行基因組學分析，能夠找出大量的與其特定代謝性質和病原性質相關的遺傳特征，經過鑒定還發現該菌株為獲得遺傳信息而能夠發生整合的不穩定區域[8]。這些研究更加有助于我們理解空腸彎曲桿菌的發病機理，特別是發現一些高致病性菌株所具有的一些獨特特征。

1.2 乳中其他致病菌的基因組學研究

金黃色葡萄球菌能夠引發乳房感染，嚴重影響牧群健康和原料乳質量，Leigh等[9]對一株分離于牛乳房炎的Str.uberis進行基因組測序分析，并對該菌株引發疾病的機理方面做了相關驗證，如果將上述結果同疾病模型和后基因組學分析相結合就能進一步闡述致病菌與宿主之間的相互作用關系。另外已經引起人們廣泛關注的菌株是來源于牛臨床分離物的菌株副結核分枝桿菌，因為它能引發牛副結核病（一種發生于牛和其它反芻動物體內的慢性持續性腸炎）。2005年，副結核分枝桿菌菌株K-10的全基因組序列已經完成，經分析其基因組共有4,829,781個堿基，4,350個ORFs，45個tRNA和一個rRNA操縱子[10]，副結核分枝桿菌基因組序列的獲得為進一步開展相關蛋白的毒力特性和生理學研究以及新的檢測牛副結核病方法的建立奠定了基礎。

1.3 乳中腐敗菌的基因組學研究

腐敗菌也是影響乳制品質量的重要因素之一，如熒光假單胞菌[5]產生的一些蛋白酶和肽酶，往往不能經過一般熱處理而失活，在產品貨架期間會產生苦味、風味淡薄及其他一些質地缺陷；而能夠形成芽孢的菌株，例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌也是主要潛在腐敗微生物，在巴氏殺菌乳中，熱處理基本上能夠失活所有不能形成芽孢的細菌，但是由于芽孢能夠在經過巴氏殺菌后存活并再次萌發同樣會對乳品質量帶來嚴重影響。上述這些細菌能夠適應多種自然環境，這是有其基因多樣性決定的，通過比較基因組雜交法分析發現，這些菌株之間存在非常大的遺傳異質性；芯片雜交顯示枯草芽孢桿菌的168個特異性基因中有近三分之一能夠表現出變異性[11]。

乳中各種病原菌和腐敗菌的污染情況與農場、飼料及貯存條件等密切關，這些污染的微生物由于生存環境和所受應激的差異，同種菌株的基因組之間存在著很大的多樣性和差異性，但是為了對食品相關細菌進行研究，我們通常選擇標準菌株或模式菌株進行研究。所以，目前在乳中污染微生物基因組研究方面存在的一個問題是，乳中存在的天然菌株與實驗室保藏的參考菌株在特性上存在許多差異，天然菌株往往具有或不具有很多參考菌株所不具有的一些特性，而這些特性又會直接在其基因組上有所體現。因此，為了更好將基因組學應用于生產實踐，我們需要了解更多來源于乳中天然菌株的基因組序列，進而對這些序列進行比較分析，以更好的反映不同菌株特性與基因組之間的聯系，為將基因組學應用于乳品生產控制方面奠定基礎。

2 基因組學在乳品生產控制上的應用

目前，國內外對臨床標本中病原菌和腐敗菌的檢驗大多仍采用所謂的“金標準”——培養法，其缺點是耗時、耗力、耗材。在對乳品生產安全的控制方面，基因組學相關技術具有逐漸取代耗時、準確性差和靈敏度不足的傳統培養和形態學試驗等方法的趨勢，而將乳品微生物檢測帶入成本更低、速度更快且診斷潛力更強的核酸技術時代。但是，需要注意的一點是，核酸技術在微生物檢測中應用的前提是乳品中關鍵要控制的微生物基因組學的研究深度，另外對該微生物進行菌種鑒定和菌株計數時靶基因的選擇也要適當。通常我們對菌株進行鑒定時所選擇的靶序列一方面要對同種微生物具有高度保守性（如16SrDNA），另一方面，又要對不同種、亞種微生物具有選擇性和靶向特異性。當針對于不同檢測目的的靶序列確定后，我們便可以對乳中污染微生物進行定量和定性檢測[12]，包括單一菌株分析和群落分析，以及一些毒性基因及抗性基因的檢測和細菌在環境應激條件下產生的各種基因突變等。

2.1 乳中細菌鑒定

以DNA為基礎的細菌鑒定技術已經發展為很多種，包括實時多聚酶鏈反應技術、靶基因序列分析、脈沖場凝膠電泳、隨機擴增多態性分析、多位點序列分析及基因芯片等。研究發現，生物細胞rDNA分子的一級結構中既具有保守區，又具有可變區。保守的片段反映了生物物種間的親緣關系，而高變的片段則表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎。在對乳中細菌進行鑒定時，靶基因一旦確定，對于我們將現有細菌鑒定方法和檢測技術結合使用來說是有利的。

MLSA是在多位點酶電泳的理論基礎上發展起來的一種分子鑒定方法，該方法最初只用于腦膜炎雙球菌的鑒定[13]，隨后該方法又成功地鑒定了幾種其他的病原菌，如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌[14]、空腸彎曲桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌[13]等。該方法利用自動化的DNA順序分析對不同管家基因上等位基因的特征進行描述。由于微生物的核甘酸序列之間存在很大的差異性，所獲得的結果可以到互聯網上相應的文庫中進行比對。該方法也適合作為通用的流行病學研究方法。

此外，能對多種不同菌種和特定微生物性狀進行快速檢測和計算的芯片技術在乳品安全控制上的研究也越來越多，Champion等利用基因芯片對111株空腸彎曲桿菌的全基因組進行比對，再通過基因分型和一些計算方法對其結果進行分析，而獲得了這一重要食源致病菌系統分化模型，這在控制該菌所引發的疾病方面具有重要意義，相應方法同樣適合其他病原微生物的研究[15]。

2.2 乳中細菌定量

在乳制品或食品的質量安全鑒定方面，快速檢測方法的開發是許多研究者所致力追求的目標。核酸診斷技術省去了傳統方法中必須進行培養的步驟，而是通過體外擴增DNA技術對食源性致病菌或腐敗菌進行定量或鑒定，與傳統方法相比，能在更短時間內對食物中單一或復雜的病原菌進行靈敏且特異性的檢測[16,17]。另外，分子生物傳感器的出現將促進在線生物分析的發展，而利用芯片技術對復雜病原菌菌群進行定量和鑒定也將是未來核酸診斷技術的一個發展方向。聚合酶鏈反應是目前來說對牛乳中微生物進行檢測時檢測限最低的一種檢測技術，雖然在實際應用PCR技術時仍然會受到一些限制，部分原因在于樣品制備上存在難度，因為乳中含量較高的脂肪和蛋白質可能會對PCR擴增起抑制作用，但是其最低檢測限仍可以達到一個細胞/mL[16]。美國國家動物健康監護系統在2002年分別利用傳統方法、常規PCR和實時定量PCR技術對全美乳樣中含有傷寒沙門氏菌的情況進行調查，結果顯示，對于從美國21個州854個農場獲得的樣品，經傳統方法檢測出的乳樣有22個，經常規PCR檢測出的乳樣有94個，而經實時定量PCR檢測出的乳樣有100個[18]。與常規PCR相比，實時PCR更不易于污染，并且勞動量更少。鑒于這些原因，實時PCR具有取代常規PCR而成為分子診斷學的常用方法。目前，實時定量PCR已經用于各類病原菌的檢測和定量，也用于一些存在于環境中的特定細菌的計數[19]。

盡管目前DNA相關檢測技術具有靈敏度高、特異性強等優點，但是由于來源于死細胞的DNA降解速度很慢，容易產生假陽性檢測結果[20]。與之相比，RNA在對乳中細菌進行檢測和鑒定方面不同于DNA，因為其在微生物死亡以后迅速降解，這樣就可以有針對性的只檢測大多數有活力的細菌。此外，mRNA和rRNA在數量上要高于基因組DNA，而能進一步降低檢測限度。因此，RNA相關技術在對乳中細菌進行檢測方面同樣具有很強的推廣優勢。

2.3 抗生素抗性基因的檢測與監控

食品企業對原料奶中抗生素殘留要求很嚴格，尤其是對發酵性乳制品來說，抗生素殘留所帶來的危害是巨大的，因為大多數發酵劑都不具備抗生素抗性。但是，伴隨著抗生素在動物飼養業中的頻繁使用，促使許多具有腐敗特性和毒性的乳品污染微生物都攜帶了抗生素抗性基因，這對人類健康及醫藥領域的發展來說是不利的，而且更為嚴重的是，這些含有抗生素抗性的污染菌不僅自身具有抗生素抗性，并且還能向人胃腸道中其他敏感細菌轉移抗生素抗性基因。從目前研究結果來看，美國在這方面的相關報道較多，例如，Murinda等曾對從牛奶場分離物中獲得的24株大腸桿菌進行鑒定[21]，研究發現其中10株大腸桿菌具有抗生素抗性，8株大腸桿菌的基因組序列中發現了Ⅰ型整合子，而且有7株大腸桿菌能夠對兩種或兩種以上的抗生素產生抗性；Ray等對分別從傳統和正規牛奶場獲得的沙門氏菌的抗生素抗性進行評價，研究認為來源于不同牛奶場的沙門氏菌對大多數抗生素而言所表現出的抗性是相似的，但是來自傳統牛奶場的沙門氏菌中至少有一株能夠同時抵抗五種抗生素[22]。

目前關于食源性病原菌在抗生素抗性基因傳播過程中所擔當的角色已經成為當前研究的重點，為了鑒定、監控和控制乳品環境中抗生素抗性基因，研究者們希望能夠通過發展基因組學技術而產生一些更特異更快速的定量監測方法。Srinivasan等對具有抗生素抗性的19株單核細胞增生李斯特氏菌的基因序列進行分析，分別發現了不同抗生素抗性基因編碼的序列[23]，如floR、penA、strA、tetA和sulI，而其他抗生素抗性基因（cmlA，strB，aadA，vanA，vanB，ampC，ermB，ereA和ereB）和剩余部分四環素抗性基因（tetB，tetC，tetD，tetE和tetG）則未能在從牛奶場中分離出來的單核細胞增生李斯特氏菌的基因組中發現；此外，Yu等采用實時定量PCR技術對來源于不同環境樣品中的三種四環素抗性基因（tetA、tetC和tetG）進行檢測[19]，并對殘留于動物糞便中的抗生素抗性基因對環境產生的影響做出趨勢判斷，這些研究都為今后攜帶抗生素抗性基因致病菌的定量檢測奠定了基礎。

3 結果與展望

對于乳品生產來說，致病菌和腐敗菌污染是影響原料乳質量的重要因素，對乳原料中微生物進行快速且準確的定量和定性一直都是行業人士的研究重點，此外，關于乳中污染微生物對環境的應激適應情況及對其殘存情況的實時監控等方面也與乳品產品質量直接相關。基因組學的發展為我們了解微生物和開發各種新興的核酸分子檢測技術奠定了基礎。在基因組學的理論指導下，一些以基因為研究對象，對乳品生產中的微生物進行定量、檢測及鑒定技術已經得以開發并應用于生產中，而且相應的研究仍在繼續，如，針對多個物種情況進行分析的宏-基因組技術或群落分析，各種致病基因和抗性基因的定位和比較以及結合蛋白質組學對致病菌產生的一些綜合性細胞應答方面的研究，當然還要進行一些適合生產實際的、低成本技術的開發，因為基因組序列分析的高成本是限制其深入研究和應用于生產的主要原因。

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