RNA干擾K-ras基因對肺腺癌H441細胞EGFR-TKI耐藥性的影響

RNA干擾K-ras基因對肺腺癌H441細胞EGFR-TKI耐藥性的影響

胡述提金冰林濤

(南陽市中心醫院胸外科，河南南陽473000)

摘要〔〕目的探討RNA干擾K-ras基因對肺腺癌H441細胞株細胞EGFR-TKI耐藥性的影響。方法構建靶向K-ras基因的表達載體并轉染肺腺癌H441細胞，分別檢測轉染后細胞中K-ras蛋白及基因表達以及對吉非替尼敏感性的改變。結果實驗組中K-ras基因及蛋白的表達量明顯低于對照組(P<0.05)；實驗組中細胞凋亡率及細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。結論靶向突變K-ras基因的siRNA可以誘導肺腺癌H441細胞凋亡，減弱對吉非替尼的耐藥性，為肺癌的基因治療提供了新的思路和方法。

關鍵詞〔〕RNA干擾;肺腺癌;吉非替尼;耐藥

中圖分類號〔〕R734.2〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：胡述提(1978-)，男，主治醫師，碩士，主要從事胸部疾病的臨床工作。

應用表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)，已使眾多肺癌患者獲益。多項臨床研究顯示，EGFR-TKI治療肺癌的療效與肺癌EGFR基因突變有關，而與EGFR蛋白免疫組織化學表達水平高低無明顯關系；對突變型基因肺癌，EGFR-TKI治療的有效率可以高達50%以上，而對野生型基因肺癌的有效率則低于10%〔1〕。K-ras基因是EGFR信號轉導通路下游的一個重要節點，該基因的突變可以引起EGFR信號通路的EGFR非依賴性持續性激活，進而導致EGFR-TKI原發性耐藥〔2〕。本研究探討RNA干擾K-ras基因對肺腺癌H441細胞株細胞EGFR-TKI耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1材料人肺腺癌H441細胞株(突變型K-ras)購自ATCC公司，在含10%胎牛血清的1640培養基中于37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，每3 d更換1次培養液，用胰酶細胞消化液〔含0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗；質粒pSilencer3.1購自Ambion公司；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；兔抗人K-ras、β-actin一抗及羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma公司。RPMI 1640培養液及胎牛血清購自美國Gibco公司。吉非替尼(商品名：易瑞沙)由Astra Zeneca公司惠贈。

1.2pSilencer3.1表達載體構建設計63 bp具有互補序列且能夠編碼shRNA的雙鏈寡核苷酸，正義：5’-GATCCGTTGGAGCTGTTGGCGTAGTTCAAGAGACTACGCCAACAGCTCCAAC TTTTTT11GGAAA-3’，反義:5’-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGAGCTGTTGGCGT-AGTCTCTTGAACTACGCCAACAGCTCCAAC G-3’，其轉錄產物所形成的siRNA作用靶點為K-ras mRNA 206～225位的核苷酸，第12位密碼子由GGT突變為GTT。陰性對照雙鏈寡核苷酸轉錄產物所形成的siRNA的作用序列為：5’-GGTTCATAAGGCGCTAGC-3’。將上述合成的雙鏈寡核苷酸退火后與pSilencer3.1線性載體定向連接并行核酸測序，命名為pSilencer3.1-K-ras。

1.3質粒轉染及細胞分組實驗分為陰性對照組、空載體組及實驗組。將生長狀態良好的H441細胞按1.5×105個/孔接種于24孔板，于37℃、5% CO2恒溫培養。次日待細胞70%～80%融合時，每孔均按總量3 μg的質粒載體分別用LipofectaminelTM進行轉染，轉染后用含G418的培養液篩選出穩定轉染的細胞并傳代。

1.4RT-PCR方法檢測K-ras mRNA 收集穩定轉染的細胞，Trizol法提取細胞總RNA。RT-PCR體系中加入兩對引物，第一對為內參β-actin基因的引物，正義引物：5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG-3’，反義引物：5’-GCTRACATGTCTCGATCCCACTRAA-3’，PCR擴增片段為394 bp；第二對是K-ras基因的引物，正義引物：5’-GACTGAATATAAACTTGTGG-3’，反義引物：5’- CTATTGTTGGATCATATTCG-3’，PCR擴增片段為107 bp。RT-PCR擴增條件：50℃ 30 min，94℃ 2 min；變性94℃ 30 s；復性58℃ 30 s及延伸72℃ 1 min，共30個循環。產物進行凝膠電泳。圖像分析系統測定灰度比值，目的片段相對表達量=K-ras灰度值/內參β-actin灰度值。

1.5Western印跡檢測K-ras蛋白的表達使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺弱膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質、轉膜、室溫封閉2 h，一抗4℃反應過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強發光底物(ECL)試劑反應發光，X線片顯影。圖像分析系統測定灰度比值。

1.6四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測細胞增殖情況建立穩定轉染細胞系后，以1×104個/ml接種于96孔培養板，100 μl/孔，自轉染當天開始，每組每天取3孔細胞，MTT法檢測各孔光密度(A)值，以570 nm處吸光度值為縱坐標，繪制出細胞生長曲線。

1.7細胞凋亡檢測胰酶消化各組細胞，調整密度為3×105個/ml，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，結合緩沖液重懸細胞，分別加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測細胞凋亡情況，使用Cell Quest軟件進行分析。

1.8統計學方法應用SPSS13.0軟件行單因素方差分析，

2結果

2.1pSilencer3.1真核表達載體的構建及鑒定將重組質粒載體pSilencer3.1-K-ras進行序列分析，測序結果正確，表明重組真核表達載體構建成功。

2.2轉染后H441細胞株K-ras mRNA的表達情況pSilencer3.1-K-ras轉染組細胞K-ras mRNA表達量(40.8%±4.2%)較對照組(92.3%±3.1%)明顯減弱(P<0.05)。空載體組灰度比值為90.6%±1.9%。

2.3轉染后H441細胞株細胞K-ras蛋白的表達情況pSilencer3.1-K-ras轉染組細胞K-ras蛋白質表達明顯抑制。空載體組、陰性對照組、實驗組的灰度比值分別為：97.2%±3.1%、96.3%±1.8%、35.1%±2.9%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4siRNA對細胞增殖的影響MMT法所測生長曲線顯示實驗組細胞增殖速度減慢，細胞生長受到抑制(P<0.05)。

2.5siRNA對細胞凋亡的影響實驗組細胞凋亡率明顯升高，為26.3%±3.2%，而空載體組、陰性對照組細胞凋亡率分別為6.9%±1.8%、8.6%±3.0%，三組相比差異顯著(P<0.05)。

3討論

EGFR-TKI是近年來肺癌治療領域的重大突破，研究結果顯示，部分NSCLC的EGFR基因存在特定的外顯子18-21突變，導致EGFR信號通路持續性激活，造成攜帶這些突變的腫瘤細胞對EGFR-TKI高度敏感〔1〕。Ras基因定位于染色體11q13，包括H-ras、K-ras和N-ras，其編碼的蛋白位于細胞膜上的鳥苷酸結合蛋白，負責將細胞外部信號轉導到內部。Ras信號傳導通路是EGFR通路的一部分，K-ras基因在多達30%的NSCLC中可出現激活性突變，且以腺癌為主，突變的K-Ras 基因不依賴上游EGFR的活化，不斷激活MAPK信號途徑的級聯反應，導致癌細胞增殖、轉移以及抵抗凋亡〔2〕。激活EGFR通路的EGFR突變使得藥物更加敏感，而激活EGFR下游ras通路的K-ras突變多引起耐藥，甚至同時攜帶EGFR突變和K-ras突變的肺癌，也可引起原發性耐藥〔3〕。對于EGFR下游通路研究顯示，突變的K-ras替代EGFR激活下游通路，從而導致EGFR抑制劑耐藥的發生。也有研究表明抑制突變K-ras的表達，可有效抑制癌細胞的生長〔2〕。

siRNA是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉錄后基因沉默的一種現象。RNA干擾技術的優點是快速、有效且序列特異性強，在某種程度上可替代傳統的反義核酸技術及基因敲除技術。研究發現RNAi抑制目的基因的作用強于反義寡核苷酸〔4〕。近年來RNAi技術已逐漸應用于腫瘤的基因治療研究，并取得一定效果，Brummelkamp等〔5〕應用逆轉錄病毒將SiRNA導入人胰腺癌、卵巢癌細胞，特異且穩定地抑制癌基因K-ras的表達，使腫瘤生長能力降低，逆轉了腫瘤細胞的惡性表型。應用RNA干擾技術特異性阻斷突變K-ras基因的表達，可為肺癌的基因治療提供了新的思路和方法。

本研究結果顯示，穩定轉染的細胞對吉非替尼的IC50明顯下降，提示干擾k-ras能一定程度地恢復H441細胞對吉非替尼的敏感性。細胞的凋亡率和吉非替尼細胞增殖抑制率均明顯升高，對吉非替尼的敏感性增強，這表明K-ras-siRNA能夠下調H441細胞內K-ras基因的表達，有效抑制ras通路的活化，進而引發一系列的細胞或分子生物學的改變。實驗結果提示，通過下調K-ras的表達可以逆轉K-ras突變細胞對吉非替尼的耐藥，因此，以突變K-ras基因為靶點，利用RNA干擾技術治療肺癌可望成為有效地基因治療方法。

4參考文獻

1Uramoto H,Mitsudomi T.Which biomarker predicts benefit from EGFR-TKI treatment for patients with lung cancer〔J〕?Br J Cancer,2007;96(6):857-63.

2Forrester K,Almoguera C,Han K.Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis〔J〕.Nature,1987;327(6120):298-303.

3Jackson EL,Willis N,Mercer K,etal.Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras〔J〕.Genes N Dev,2001;15(24):3243-8.

4Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,etal.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals〔J〕.Cell,2000;101(1):25-33.

5Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference〔J〕.Cancer cell,2002；2(3):243-7.

〔2014-11-07修回〕

(編輯袁左鳴)