斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)研究及環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

劉輝，戴家銀

（1.中國科學(xué)院動(dòng)物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，安徽蚌埠 233030）

研究進(jìn)展

斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)研究及環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

劉輝1，2，戴家銀1*

（1.中國科學(xué)院動(dòng)物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，安徽蚌埠 233030）

斑馬魚作為一種新型的模式動(dòng)物，由于其易于飼養(yǎng)、體外受精、產(chǎn)卵量大、胚胎透明及體外發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物研究的多個(gè)領(lǐng)域。近年來，斑馬魚及其胚胎也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域；并且隨著轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)的建立，斑馬魚及其胚胎將更好地應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究和環(huán)境監(jiān)測。

斑馬魚；生態(tài)毒理學(xué)；環(huán)境監(jiān)測；轉(zhuǎn)基因

斑馬魚（英文名：zebrafish，拉丁文名：Danio rerio）也稱為藍(lán)條魚、花條魚、藍(lán)斑馬魚、印度魚或印度斑馬魚等，屬于硬骨魚類，輻鰭亞綱（Actinopterygii），鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），魚丹屬（Danio）。斑馬魚為淡水魚類，原產(chǎn)于孟加拉、印度、巴基斯坦、緬甸和尼泊爾的溪流中，因全身布滿多條深藍(lán)色縱紋與相間排列的銀白色或金黃色縱紋，形似斑馬而得名斑馬魚。上世紀(jì)70年代，美國科學(xué)家首次把斑馬魚引入實(shí)驗(yàn)室研究，自1981年，《Nature》雜志刊登美國遺傳學(xué)家George Streisinger關(guān)于斑馬魚的論文后，斑馬魚作為一種新型模式動(dòng)物開始廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究。斑馬魚在我國生物科學(xué)方面的研究始于1998年，孟安明院士在清華大學(xué)建立國內(nèi)第一家以斑馬魚為模式動(dòng)物的發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。發(fā)展至今，斑馬魚成為大鼠、小鼠以外第三種廣泛使用的模式動(dòng)物應(yīng)用于各領(lǐng)域的科學(xué)研究。

目前，斑馬魚信息網(wǎng)絡(luò)（Zebrafish Information Network，ZFIN：http：//www.zfin.org/）數(shù)據(jù)庫已較為完備。在生物學(xué)上，斑馬魚和人類基因有高達(dá)87%的同源性，大多數(shù)人類基因都有斑馬魚的直系同源基因，這意味利用斑馬魚做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此它被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。它成為幫助人類攻克疑難雜癥的得力助手，被譽(yù)為“水中小白鼠”。除了幫助人類了解疾病病理以外，斑馬魚還是環(huán)境檢測的“活試劑”，由于斑馬魚對外界環(huán)境變化極為敏感，轉(zhuǎn)基因斑馬魚在遇到一些特定物質(zhì)的時(shí)候體色會(huì)發(fā)生變化，利用這種特性，部分歐美國家開始在河流湖泊中放養(yǎng)斑馬魚，來實(shí)時(shí)檢測水質(zhì)狀況。

1 斑馬魚及其胚胎在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 斑馬魚及其胚胎在急性毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

魚類急性毒性試驗(yàn)通常用于評價(jià)環(huán)境污染物包括工業(yè)廢水、農(nóng)藥、殺蟲劑、除草劑、洗滌劑以及藥物等物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，很多國家也將魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)用作常規(guī)的廢水檢測模型。斑馬魚胚胎最早應(yīng)用在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域是Nagel等［1］2002年使用斑馬魚胚胎替代魚類96 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)。由于其胚胎和成體的急性毒性結(jié)果一致性很好，胚胎在毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用更能節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間及成本，德國廢水收費(fèi)法案中要求把魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)替換成斑馬魚胚胎毒性實(shí)驗(yàn)（fish embryo test，F(xiàn)ET）［2］。

在斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)中，通常要計(jì)算斑馬魚胚胎發(fā)育過程中三個(gè)階段的半致死濃度（median lethal concentration，LC50）：胚胎早期的囊胚期（大約3 hpf），幼魚開口期（72 hpf）和幼魚浮游期（120 hpf）［3］。具體的生物檢測按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）頒布的魚類早期毒性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則進(jìn)行［4］。

Kovacs等［5］利用斑馬魚和胚胎的急性及亞急性毒性實(shí)驗(yàn)開展了4種環(huán)境殘留抗腫瘤藥物的毒性評價(jià)，包括：5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、順氯氨鉑（cisplatin，CisPt）、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（etoposide，ET）和甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM），并認(rèn)為這四種環(huán)境劑量的抗腫瘤藥物屬于低毒性物質(zhì)，對斑馬魚的毒性作用不大。同時(shí)急性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些藥物都有抑制DNA復(fù)制的作用，仍需要進(jìn)一步通過慢性毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所以斑馬魚及其胚胎的急性和亞急性毒性實(shí)驗(yàn)還能為化學(xué)品毒性的深入研究提供一些基本信息。

Liu等［6］利用斑馬魚胚胎開展了一種持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants，POPs）—全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）的急性毒性研究，發(fā)現(xiàn)PFNA對斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩并伴有各種畸形。8 hpf和24 hpf半致死濃度（LC50）分別為 342和 302μmol/L。400 μmol/L暴露條件下所有胚胎在8 hpf全部死亡，胚胎死亡率與畸形率均與PFNA的濃度呈正相關(guān)。

1.2 斑馬魚在慢性毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

急性毒性實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是能在較短時(shí)間內(nèi)粗略判斷某種物質(zhì)的毒性作用，但是，更為真實(shí)和全面的反映某種化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中的毒性，還需模擬真實(shí)環(huán)境，開展低濃度和長時(shí)間暴露的慢性毒性實(shí)驗(yàn)，因此，斑馬魚作為慢性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著優(yōu)勢，以斑馬魚及其胚胎作為實(shí)驗(yàn)對象有利于節(jié)約空間，由于其繁殖量大及周期短等優(yōu)點(diǎn)能有效的節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本及時(shí)間，更重要的是化學(xué)品在流水暴露條件下更貼近于真實(shí)水體環(huán)境，在這些方面是大、小鼠等嚙齒動(dòng)物無法比擬的。因此，有毒物質(zhì)低濃度、長時(shí)間暴露實(shí)驗(yàn)更加受到生態(tài)毒理學(xué)家的關(guān)注。OECD還專門制定了關(guān)于魚類14d延長毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法和觀察化學(xué)物質(zhì)干擾魚類內(nèi)分泌系統(tǒng)的21d魚類實(shí)驗(yàn)方法［7，8］。

下面從斑馬魚在肝臟毒性、生殖發(fā)育及內(nèi)分泌干擾毒性以及心血管毒性等方面的應(yīng)用進(jìn)行論述。

1.2.1 斑馬魚在肝臟毒性研究中的應(yīng)用

肝臟是重要的代謝器官，也是重要的解毒器官。目前，在藥物或者環(huán)境污染物毒性實(shí)驗(yàn)中，仍然以大鼠、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)檢測藥物或污染物的肝臟毒性為主。但這些方法還存在一些局限性，例如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確反映藥物或污染物在體內(nèi)微環(huán)境下的毒性或作用；嚙齒動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)資金。近十年來，國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚可用于構(gòu)建多種人類疾病模型并用于藥物或污染物的肝臟毒性研究，而且斑馬魚及其胚胎在肝臟毒性方面的研究也更加符合國際上倡導(dǎo)的毒理實(shí)驗(yàn)3R（Replacement，Reduction and Refinement）原則［9］。

Zhang等［10］通過雙向凝膠電泳及質(zhì)譜分析方法，探討了慢性PFNA暴露斑馬魚成魚后，肝臟內(nèi)蛋白譜表達(dá)的變化情況，鑒定了57個(gè)可能與PFNA肝臟毒性效應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，主要涉及物質(zhì)代謝與能量代謝、蛋白質(zhì)降解與修飾、氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期調(diào)控等。進(jìn)一步研究部分差異表達(dá)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)蛋白翻譯水平變化與mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化并不完全一致，提示了PFNA暴露后，生物體可能存在著復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯調(diào)控機(jī)制。Zhang等［11］采用PFNA流水式暴露斑馬魚180 d的研究方法，評估了PFNA在斑馬魚肝臟的累積水平和肝臟毒性效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性PFNA暴露導(dǎo)致雌、雄斑馬魚肝臟內(nèi)總膽固醇（Total cholesterol，TCHO）的含量升高；而甘油三酯（triglyceride，TG）的含量在雌、雄魚之間存在明顯的性別差異，即雄魚升高而雌魚下降的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)與一些暴露于全氟烷酸類化合物（perfluoroalkyl acids，PFAAs）的職業(yè)工人血清膽固醇結(jié)果類似，即PFOS和PFOA與膽固醇含量之間有正相關(guān)關(guān)系［12］。這些結(jié)果暗示，斑馬魚可能是一個(gè)更合適研究PFAAs影響膽固醇的模式動(dòng)物。同樣在基因表達(dá)水平變化的檢測也發(fā)現(xiàn)慢性PFNA暴露后，脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding proteins，F(xiàn)ABPs）及其上游調(diào)控基因過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT-enhancer-binding proteins，C/EBPs）的轉(zhuǎn)錄水平與各自對照組相比，在雄魚中顯著升高，而在雌魚中則顯著下降。有研究指出，PFAAs暴露所引起的基因表達(dá)的性別間差異可能來源于其對PFAAs的清除速率不同［13］。這種雌雄個(gè)體清除速率的差異可能是由于腎臟中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的差異表達(dá)，這些差異可能產(chǎn)生于性別分化期［14］。

Liu等［15］在全氟十二碳羧酸（perfluorododecanoic acid，PFDoA）暴露斑馬魚成魚實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PFDoA可以引起斑馬魚明顯的肝臟病理學(xué)損傷，導(dǎo)致超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等發(fā)生顯著變化，并最終導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過氧化。在基因水平上，PFDoA處理顯著地改變肝臟中與線粒體脂肪酸代謝和抗氧化相關(guān)的基因的表達(dá)。能夠顯著性地抑制pparα，cpt1，ucp-2和bcl-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。說明PFDoA能夠通過干擾肝臟線粒體中脂肪酸的代謝，進(jìn)而干擾線粒體中能量產(chǎn)生途徑，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生并影響抗氧化系統(tǒng)，最終引起肝臟氧化損傷。

1.2.2 斑馬魚及其胚胎在生殖內(nèi)分泌干擾毒性研究中的應(yīng)用

近年來，斑馬魚也成為研究生殖內(nèi)分泌干擾毒性的模式動(dòng)物之一。目前在環(huán)境中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有900多種內(nèi)分泌干擾物（endocrine-disrupting chemicals，EDCs），其中有超過200多種被認(rèn)為具有雌激素效應(yīng)［16］，所以近來有關(guān)環(huán)境污染物對斑馬魚生殖內(nèi)分泌干擾毒性的研究也引起了廣泛地關(guān)注。Deng等［17］研究發(fā)現(xiàn)，三溴苯酚（tribromophenol，TBP）暴露斑馬魚120 d后，顯著降低了斑馬魚產(chǎn)卵量；Carnevali等［18］也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)暴露鄰苯二甲酸酯（Di-（2-ethylhexyl）-phthalate，DEHP）3周后，顯著降低了斑馬魚的產(chǎn)卵量。

Wang等［19］開展了斑馬魚成魚暴露一種有機(jī)磷酸酯阻燃劑-磷酸三（2，3-二氯丙基）酯（tris（1，3-dichloro-2-propyl）phosphate，TDCPP）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TDCPP可以從成魚傳遞給F1代，并顯著增加F1代幼魚體內(nèi)的ROS含量，降低存活率，降低血清中甲狀腺素水平；F0代雌魚和F1胚胎或幼魚的T3也顯著下降。

Liu等［20］開展斑馬魚慢性暴露PFNA的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露PFNA 180 d后，斑馬魚F0代和F1代成體魚血漿中的T3水平顯著升高，同時(shí)F0代成體斑馬魚甲狀腺濾泡的病理組織切片結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。肝臟中的甲狀腺激素結(jié)合蛋白（transthyretin，TTR）基因的表達(dá)量顯著上升，而F0代斑馬魚肝臟內(nèi)的磷酸尿苷葡萄糖苷（基）轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UDPG）表達(dá)水平顯著受到抑制。PFNA的長期暴露表現(xiàn)出了明顯的甲狀腺干擾效應(yīng)。

1.2.3 斑馬魚及其胚胎在心血管毒性研究中的應(yīng)用

斑馬魚由于其在體外發(fā)育，并且胚胎透明，可以在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察心血管的生成，所以在心血管研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。Gerger等［21］用斑馬魚成魚進(jìn)行苯并芘（Benzo［a］pyrene）暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)成魚暴露后，耗氧量明顯增加，心率明顯下降，肝臟和心臟組織的cyp1a基因表達(dá)量也明顯升高，苯并芘對斑馬魚的心血管系統(tǒng)有明顯的毒性作用。Zhang等［22］在用菲（phenanthrene，Phe）暴露斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)菲能夠損傷斑馬魚的心血管系統(tǒng)，造成了心室水腫、心室內(nèi)壁變大變薄、小腸纖維化等現(xiàn)像，而基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）可以緩解菲的毒性效應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這一毒性效應(yīng)與TGF-β通路激活有關(guān)。

Liu等［6］利用斑馬魚胚胎進(jìn)行PFNA暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PFNA可導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩，孵化率降低心室水腫和脊椎彎曲。另外，PFNA暴露可顯著增加幼魚體內(nèi)的ROS的含量。并發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與lfabp和ucp2基因的表達(dá)顯著升高，sod1和mtnd1基因的表達(dá)水平顯著下降有關(guān)。

2 斑馬魚及其胚胎在環(huán)境監(jiān)測與評價(jià)中的應(yīng)用

2.1 在水體無機(jī)物重金屬離子監(jiān)測中的應(yīng)用

檢測環(huán)境中重金屬污染最常用的方法就是用斑馬魚及其胚胎進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)［23，24］。重金屬通?？梢砸种泼傅幕钚裕?4ˉ26］或者影響基因的表達(dá)［27ˉ28］。所以可以通過檢測斑馬魚成魚或者胚胎的酶活性或者生物標(biāo)志物基因的表達(dá)來間接地反映水體環(huán)境中的重金屬污染。例如，Ling等［29］發(fā)現(xiàn)一些酶的活性，包括SOD、CAT和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的酶活性受Cd、Zn或者甲基對硫磷（methyl parathion）的暴露而變化。這三種酶可以作為環(huán)境中復(fù)合污染的生物標(biāo)志物。Leite等［30］發(fā)現(xiàn)斑馬魚暴露Cu2+后，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，氧化壓力，并伴隨炎癥反應(yīng)相關(guān)基因il-1β，tnf-α，cox-2和pge2基因表達(dá)的變化。Wang等［31］發(fā)現(xiàn)斑馬魚在Cu2+暴露后，嗅覺系統(tǒng)中與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的一些miRNA的表達(dá)量，如let-7，miR-7a，miR-128和miR-138發(fā)生了顯著下調(diào)，這可能與Cu2+介導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生毒性相關(guān)。這些表觀遺傳的改變也可以作為檢測重金屬污染的新型生物標(biāo)志物。

2.2 在有機(jī)污染物監(jiān)測中的應(yīng)用

環(huán)境中除了無機(jī)重金屬污染之外，近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的有機(jī)污染物被頻繁檢出，并且這些有害有機(jī)污染物的對環(huán)境及人類健康的影響已經(jīng)引起流行病學(xué)家和生態(tài)毒理學(xué)家的廣泛關(guān)注。常見的有機(jī)污染物如-多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等，可以干擾斑馬魚的內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響胚胎發(fā)育、損傷DNA并且導(dǎo)致氧化壓力［32，33］。這一類化合物不僅具有發(fā)育毒性［34］，而且也會(huì)影響心血管系統(tǒng)發(fā)育及其相關(guān)基因的表達(dá)［35］。

全氟烷酸類化合物（perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances，PFASs）是一種新型持久性有機(jī)污染物，在環(huán)境中廣泛檢出。最近研究顯示PFASs能通過食物鏈富集放大，因此，對人類及野生動(dòng)物的健康具有潛在的威脅。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）和全氟辛磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）是最常見的兩種全氟烷酸類化合物，它們都能夠影響斑馬魚的胚胎發(fā)育［36］。Du等［37］研究發(fā)現(xiàn)，PFOS暴露斑馬魚成魚后，影響雌激素受體和甲狀腺受體活性，降低了睪酮水平，升高了雌二醇水平；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，PFOS能夠顯著增加甲狀腺發(fā)育相關(guān)基因hhex和pax8的表達(dá)，降低甾類生成相關(guān)酶的基因cyp17，cyp19a和cyp19b的表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度（劑量）-效應(yīng)關(guān)系，檢測這些基因的表達(dá)變化為環(huán)境監(jiān)測提供一個(gè)可行的方法。

此外，斑馬魚在水體中殺蟲劑和抗生素等污染監(jiān)測中也有著廣泛的應(yīng)用。Huang等［38］研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的游泳行為與水體中一種殺蟲劑-溴氰菊酯（deltamethrin，DM）的濃度有相關(guān)性。水體中DM的濃度達(dá)到1%就能夠影響斑馬魚的游泳行為。在暴露的最初2h內(nèi)，斑馬魚的游泳速度和深度會(huì)受到明顯的影響，這被認(rèn)為是監(jiān)測水質(zhì)最重要的時(shí)期。此外，還發(fā)現(xiàn)斑馬魚極度活躍的時(shí)間和浮出水面的時(shí)間與DM暴露濃度均呈現(xiàn)指數(shù)相關(guān)關(guān)系，這兩個(gè)參數(shù)可以作為區(qū)分水體DM污染級別的重要指標(biāo)。

2.3 在水體環(huán)境類雌激素監(jiān)測中的應(yīng)用

近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)如PFNA、雙酚A（bisphenol A，BPA）等在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出現(xiàn)雌激素效應(yīng)［39］，這些物質(zhì)在水體環(huán)境中可能是扮演一種雌激素的效應(yīng)，被稱為“環(huán)境雌激素（xenoestrogens）”［40］。Urbatzka等［41］用含有11種環(huán)境雌激素的杜羅河（位于葡萄牙）河口的水暴露斑馬魚成魚21d后，并用17α-乙炔雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE2）作為陽性對照，篩選出star、17β-hsd1、cyp19a1候選基因可用于水體環(huán)境中類雌激素的監(jiān)測。Notch等［42］以斑馬魚胚胎為模型進(jìn)行環(huán)境雌激素的暴露研究，斑馬魚胚胎在0 hpf時(shí)即進(jìn)行EE2的暴露，并在12、24、48、72和96 hpf取樣研究，發(fā)現(xiàn)在24 hpf時(shí)，卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG）的mRNA的表達(dá)水平就已經(jīng)顯著升高，這一基因的表達(dá)變化可以作為雌激素暴露的生物指示物。

2.4 轉(zhuǎn)基因斑馬魚在環(huán)境監(jiān)測與評價(jià)中的應(yīng)用

盡管野生型斑馬魚及其胚胎已廣泛地應(yīng)用于環(huán)境污染物的毒性監(jiān)測，但是這種方法仍然有不足之處，例如，檢測靈敏度相對較低，以及實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果統(tǒng)計(jì)計(jì)算相對繁瑣等。最近，隨著遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也日益成熟，轉(zhuǎn)基因斑馬魚也越來越多地應(yīng)用于藥物篩選和環(huán)境毒物監(jiān)測領(lǐng)域。近年來，隨著斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)的完善，轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)也迅速發(fā)展，目前，已有很多種技術(shù)成功地應(yīng)用于斑馬魚的轉(zhuǎn)基因研究。如GAL4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)［43］、Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)［44］和ΦC31整合酶系統(tǒng)［45］等。

目前，應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測的轉(zhuǎn)基因斑馬魚主要有以下五種類型：芳香烴反應(yīng)元件（aromatic hydrocarbon response element，AHRE）、親電反應(yīng)元件（electrophile response element，EPRE）、金屬離子反應(yīng)元件（metal response element，MRE）、雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）和維甲酸和類維生素A X反應(yīng)元件（retinoic acid and retinoid x response elements， RAREs， RXREs）［46］。 Petersen等［47］構(gòu)建了一種雌激素反應(yīng)元件轉(zhuǎn)基因斑馬魚tg（cyp19a1b-GFP）用于環(huán)境中類雌激素的監(jiān)測，在研究中，分別用5種不同的環(huán)境雌激素暴露轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎96 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有潛在的和弱的類雌激素都能夠檢測到。Chen等［48］構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在這種魚的體內(nèi)，利用vtg1的啟動(dòng)子調(diào)控報(bào)告基因EGFP的表達(dá)，直觀地檢測水環(huán)境中的雌激素污染。通過熒光顯微鏡直接觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚的綠色熒光，可以直接判斷水樣中是否有雌激素污染，為環(huán)境雌激素的監(jiān)測提供了一種便捷的工具。

3 前景展望

斑馬魚是一個(gè)相對“年輕”的模式生物，但是在最近30年，它在脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)以及人類疾病研究方面發(fā)揮了重要的作用。作為一種模式動(dòng)物，應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，具有節(jié)約費(fèi)用，易于飼養(yǎng)，節(jié)約空間等諸多優(yōu)點(diǎn)。尤其是在轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系建立后，用于環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)越性日益體現(xiàn)出來，轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于環(huán)境監(jiān)測比野生型斑馬魚更加快速、更加靈敏、更加方便，能夠反映不同污染類型。在不久的將來，轉(zhuǎn)基因斑馬魚將會(huì)成為環(huán)境和水質(zhì)監(jiān)測的“哨兵”生物。

近年來，組學(xué)（-omics）不斷興起，尤其轉(zhuǎn)錄組測序及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也得到了迅速發(fā)展，這將更加有利于以斑馬魚為研究模型研究環(huán)境污染物對人類健康危害和生物標(biāo)志物的篩選。隨著科學(xué)技術(shù)手段的不斷改進(jìn)，將來會(huì)有更多的轉(zhuǎn)基因（反應(yīng)元件）斑馬魚品系的建立，為活體監(jiān)測多種微量環(huán)境污染物監(jiān)測提供可能。各種帶有不同反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)基因斑馬魚卵可以像基因芯片一樣排列在微孔板中，可以準(zhǔn)確地檢測出水環(huán)境中各種污染物的種類，并可以根據(jù)熒光強(qiáng)度來推算污染物的濃度。另外，轉(zhuǎn)基因斑馬魚的GFP元件可以替換成其他新型的元件，在污染物存在的情況下可以直接發(fā)光，而不需要在熒光顯微鏡下觀察，這樣也會(huì)大大增加轉(zhuǎn)基因斑馬魚在野外直接檢測水體環(huán)境污染物的便捷性，使得轉(zhuǎn)基因斑馬魚在環(huán)境監(jiān)測中更好地發(fā)揮作用。

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Application of zebrafish（Danio rerio）in the fields of environmental ecotoxicology and environmentalmonitoring

LIU Hui1，2，DAIJia-yin1*
（1.Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology，Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China；2.Department of Laboratory Medicine，Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui233030）

Zebrafish，a new type ofmodel animal，has been widely used in many fields of biological research because of its low cost，ability of external fertilization，high fecundity，allowance of embryo transplant，and ectogenesis.Recently，zebrafish and its embryos have been widely used in ecotoxicological studies and environmentalmonitoring.Furthermore，with thematuration of zebrafish transgenic techniques，a new era has come for environmental pollution monitoring.

Zebrafish（Danio rerio）；Ecotoxicology；Environmentalmonitoring；Transgene

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0529-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.017

2015-08-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃：2013AA065203）資助。

劉輝，男，博士，研究方向：生物化學(xué)，分子生物學(xué)。

戴家銀，博士，研究方向：生態(tài)毒理學(xué)。Email：daijy@ioz.ac.cn