現有液體培養法檢測解脲脲原體效果的評價

周良佳，連大帥，許 鍇，伊科拉木，普瓊次仁，吳建茹，陳璐斯，楊 天，謝彥昕，王 蓓

現有液體培養法檢測解脲脲原體效果的評價

周良佳，連大帥，許 鍇，伊科拉木，普瓊次仁，吳建茹，陳璐斯，楊 天，謝彥昕，王 蓓

目的 以固體培養基為金標準，對現有液體培養法進行評價，并進一步探討改良的方法。方法 用液體培養基、新型固體培養基及梅里埃培養基平行檢測63例臨床宮頸分泌物試子，根據靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率等指標對現有液體培養法、梅里埃培養基檢測Uu的效果進行評價。結果 液體培養法Uu檢出率為36.7%，梅里埃培養基Uu檢出率為66.7%，新型固體培養基Uu檢出率為84.1%。以固體培養基為金標準，液體培養法的靈敏度較低(42.0%)，假陰性率較高(58.0%)，特異度尚可(90.0%)。梅里埃培養基檢測Uu的靈敏度(72.9%)明顯優于液體培養法(42.0%)。結論 有過濾步驟的傳統液體培養法的假陰性率過高，考慮改良現有液體培養基，提高檢測支原體的真實性和可靠性，建立方便使用且結果真實可靠的檢測Uu的方法。

解脲脲原體；液體培養基；新型固體培養基；梅里埃培養基

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，Uu)是泌尿生殖道的常見微生物，與許多泌尿生殖道疾病，如非淋菌性尿道炎、宮頸炎、陰道炎有關，也是男性不育、女性不孕及不良妊娠的常見病因之一。因此，準確檢測Uu對臨床診斷和治療具有重要意義。目前，國內對支原體的臨床檢測常采用液體培養法，這一方法方便、快捷、靈敏度高，已沿用近20年，但液體培養僅是生化反應，而生化反應不是支原體所特有的，一旦有其他能分解尿素的微生物在培養基中生長，就會導致假陽性判斷。固體培養法可以通過顯微鏡觀察支原體特有的菌落形態，是微生物診斷的直接證據。但由于支原體在固體培養基上菌落形態小，需借助顯微鏡方法觀察，且生長環境需要CO2，生長時間長，沒有藥敏鑒定，不適合臨床常規檢查。近年來，上海葉元康等學者研制開發了新型固體培養基，與傳統固體培養基相比，選擇性強，支原體菌落出現早，特征易于判斷，但該新型固體培養基在臨床還未能得到廣泛應用。本研究將采用新型固體培養基、現有液體培養基、梅里埃培養基，通過對婦科及性病門診就診者泌尿生殖道標本的平行檢測，對現有液體培養法的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率以及符合率進行評價。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 泌尿生殖道標本取自婦科門診有泌尿生殖道感染癥狀的就診者，采用無菌的試子采取女性宮頸分泌物，標本采集后立即送檢。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 液體培養基 國內常用的Uu液體培養基，購自南京黎明生物制品有限公司；新型固體培養基：含有多胨等基礎營養成分和0.9%瓊脂，增加血清含量，添加細胞培養液(10%DMEM)促進支原體生長，抑菌劑除傳統的青霉素外還添加了非抗生素類抑菌成分，購自河北微拉生物科技有限公司；梅里埃培養基：法國Bio-Merieux公司的Mycoplasma ID2培養基。具有半定量計數功能，可檢測標本中支原體數量是否超過104ccu/mL，并以此判斷“正常攜帶”或“感染”。該試劑及判斷界值已為國際上所公認。

1.2.2 儀器 SHEL LAB恒溫培養箱，SW-CJ-1F凈化工作臺，培養瓶，直徑25 mm濾菌器，孔徑0.22 μm濾膜，2 mL注射器，奧林巴斯Olympus FSX100智能生物圖像導航儀。

1.3 培養方法與結果判讀 將采集的宮頸分泌物試子洗脫于1 mL生理鹽水中，此為樣本洗脫液。嚴格按照各種檢測試劑的使用說明，在無菌條件下將樣本洗脫液分別接種于液體、新型固體培養基和梅里埃試劑盒的各個培養孔中，同時設立陰、陽性對照(陰性對照為培養基空白對照，陽性對照為本實驗室保留的Uu標準菌株接種于各種培養基上)，置37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h，48 h各觀察1次。

1.3.1 液體培養法的步驟與結果判讀 取150 μL洗脫液接種到1.5 mL液體培養基中，標記好后置37 ℃恒溫培養箱中培養。在陰性對照保持黃色澄清和陽性對照變紅色澄清的前提下，1代培養物由黃轉紅判為1代陽性，然后用濾膜孔徑為0.22 μm的濾膜進行過濾并再培養，1代陽性過濾后培養液由黃色變為紅色且澄清判為陽性，出現紅色混濁表示受到污染，則剔除。1代以及2代培養液顏色為黃色的判為陰性。

1.3.2 固體培養法的步驟與結果判讀 取150 μL(約5～6滴)洗脫液均勻平鋪于新型固體培養基上，標記好后置37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h，48 h各觀察1次。經48 h的培養后，于低倍鏡中觀察可見到特征性的菌落。解脲脲原體菌落小，圓形棕褐色，呈棕黑色海膽樣菌落(10～50 μm)，黑色的芯子和褐色周邊。

1.3.3 梅里埃培養法的步驟與結果判讀 取200 μL洗脫液接種于梅里埃培養基的R1劑中混勻，然后與R2劑振蕩混勻，并分別接種于鑒定試劑條的各反應杯內，每反應杯加55 μL，標記好后置37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h，48 h各觀察1次。在24 h和48 h孵育后，尿素-精氨酸肉湯顏色為橙至紅色都可判讀為陽性，肉湯顏色為黃色時判讀為陰性。支原體鑒定試劑條的鑒定孔，顏色為橙色至紅色可判定為陽性，黃色為陰性；計數孔顏色呈紅色判斷為陽性即Uu的數量>104ccu/mL，計數孔顏色為黃色至橙色可判斷為陰性即Uu的數量<104ccu/mL。

1.4 統計學分析 建立檢測結果的Excel數據庫，用Spss19.0軟件進行數據分析。采用配對χ2檢驗對不同培養基檢測Uu的結果進行比較分析，P<0.05為差異有統計學意義。采用靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率以及符合率等指標對現有液體培養法進行綜合評價。

2 結 果

2.1 不同培養基對解脲脲原體的檢出情況 本次共采集臨床宮頸分泌物樣本63例。液體培養基Uu初篩陽性率為77.8%(49/63)，過濾后Uu檢出率36.7%(22/60)；梅里埃尿素-精氨酸肉湯陽性率為71.9%(41/57)，Uu檢出率為66.7%(38/57)，其中Uu感染率(Uu計數≥104ccu/mL)為35.1%(20/57)；新型固體培養基24 hUu檢出率為69.8%(44/63)，48 hUu檢出率為84.1%(53/63)。Uu在固體培養基上24 h、48 h、72 h的菌落形狀見圖1-3，這3張圖均為同一視野，同一放大倍數拍照，箭頭所指為同一Uu菌落在不同時間的菌落形狀，可見，Uu菌落隨時間在不斷生長，不斷增大。

2.2 3種培養基的檢測結果比較

2.2.1 液體培養基檢測Uu效果評價 以固體培養法48 h檢測結果為金標準，計算液體培養法檢測Uu的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率以及符合率,結果見表1。由表1可知，液體培養法初篩陽性率與固體培養法檢出率沒有差異(χ2=0.643，P=0.424)，但若以液體培養法初篩Uu為檢測結果，則特異度較低(50.0%)，假陽性率過高(50.0%)。液體培養法過濾后Uu檢出率36.7%明顯低于固體培養基48hUu檢出率83.3%，差異有統計學意義(χ2=24.300，P<0.001)。液體培養法的靈敏度較低(42.0%)，假陰性率較高(58.0%)，特異度尚可(90.0%)。

Fig.1 24 h (twenty-four hours) colonial morphology ofUuin solid

View from Olympus FSX100 Intelligent creatures image navigation, 400×; plotting scale: 100 μm, the arrow points a singleUucolony.

圖3Uu在固體培養基72 h的菌落形狀

Fig.3 72 h colonial morphology ofUuin solid

2.2.2 梅里埃培養基檢測Uu效果評價 以固體培養基48 h檢測結果為金標準，計算梅里埃培養基檢測Uu的靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率以及符合率(結果見表2)。由表2可知，梅里埃培養基檢測Uu陽性率66.7%低于固體培養基48hUu陽性率84.2%，差異有統計學意義(χ2=5.063，P=0.021)。

2.2.3 液體培養基與梅里埃培養基檢測Uu效果比較 根據Mycoplasma IST試劑的檢測結果，以≥104ccu/mL為感染判斷標準，≤104ccu/mL為正常攜帶，比較液體培養法Uu檢出率與梅里埃培養基Uu檢出率，以及比較液體培養法Uu檢出率與梅里埃培養基Uu感染率(結果見表3)。由表3可見，液體培養法的Uu檢出率(38.9%)明顯低于梅里埃培養基Uu檢出率(70.4%)，差異有統計學意義(χ2=13.474，P<0.001)，并且同樣都以固體培養基為金標準，梅里埃培養基檢測Uu的靈敏度(72.9%)明顯優于液體培養法(42.0%)。由表3可見，比較液體兩步法的Uu檢出率(38.9%)與梅里埃培養基檢測出的Uu感染率(37.0%)，兩者差異沒有統計學意義(P=1.000)。

3 討 論

目前認為，解脲脲原體是性傳播疾病的主要病原體之一，在女性泌尿生殖道有很高的攜帶率(60%～80%)。國外有文獻[1]報道，在1 718例泌尿生殖道感染患者中，Uu的檢出率為16%，高于陰道毛滴蟲(0.2%)，淋病奈瑟菌(0.6%)，生殖支原體(1%)，沙眼衣原體(8%)這些病原體的檢出率；國內也有文獻[2]報道，女性泌尿生殖道感染中Uu感染率為50.6%，高于淋球菌3.1%、沙眼衣原體10.9%、人型支原體6.3%、念珠菌(20.2%)和滴蟲(2.0%)，可見Uu是泌尿生殖道感染的主要病原體之一。

本研究通過對63例宮頸分泌物樣本進行Uu檢測，固體培養法48 hUu的檢出率為84.1%，梅里埃培養法Uu檢出率為66.7%。由于本次采集的樣本均來自于有明顯泌尿生殖道癥狀的感染就診者，故Uu的檢出率較高。國內外對相似人群的Uu檢出率60%～80%左右均有報道。郭愛霞等[3]對1462例泌尿生殖道感染女性患者進行Uu檢測，檢出率為54.58%；李軼春等[4]用梅里埃培養基進行婦科門診有生殖道炎癥女性泌尿生殖道標本的Uu檢測，Uu檢出率為49.67%，Uu<104ccu/spec為30.33%,Uu≥104ccu/spec為19.33%；葛萍等[5]對同樣人群Uu的檢出率為87.8%；國外也有同類研究[6]，其對255份有癥狀女性陰道分泌物樣本進行Uu檢測，檢出率為68.9%。

既往許多文獻[7- 8]報道，液體培養法是生化反應，特異性差，不是支原體所特有，一旦有分解尿素的細菌和真菌就會出現陽性反應，從而導致支原體假陽性判斷。既往也有文獻[9]報道，液體培養法檢測Uu的靈敏度(85.4%)和特異度(90%)都尚可，且不存在假陽性問題。從本實驗結果可知，液體培養法的特異度很高(90.0%)，反而靈敏度較低(42.0%)，假陰性率較高(58.0%)。這提示我們在使用液體培養法檢測Uu時，要注意假陰性判斷。造成液體培養法假陰性率較高的原因，可能是在液體培養過程中采用了過濾這一流程，過濾的時機比較難把握，過早或過晚都會影響過濾后支原體的生長效果，繼而可能導致了假陰性率的升高。若省略過濾這一步驟，單純以液體培養基的初篩結果為檢測Uu的結果，則特異度太低(50.0%)，假陽性率過高(50.0%)，且這一結果與陳紅霞等[7]報告的59.69%的假陽性率相似，所以單純以現有液體培養基一代培養陽性為檢測結果也是不可取的。

法國Bio-Merieux公司的Mycoplasma IST培養基對Uu的診斷結果及判斷界值已被國際上所公認。這次以固體培養基為金標準評價梅里埃培養基的靈敏度與特異度等指標時發現，梅里埃培養基的靈敏度與特異度并不是很高，國外也有研究[10]評價了梅里埃培養基的靈敏度(44.9%)與特異度(87.9%)，靈敏度也不高。這可能是由于梅里埃培養基也是基于生化反應，在指示劑的作用下達到一定的顏色改變以作陽性判斷，所以梅里埃培養基有一定的檢測限。固體培養基的優點在于靈敏度高，檢測限低，且以通過顯微鏡觀察支原體特有的菌落形態，是微生物診斷的直接證據。梅里埃培養基雖然靈敏度不如固體培養基，但其可以做半定量計數檢測，判斷感染與正常攜帶，對臨床診斷及用藥有一定的參考意義，而固體培養基只能鑒定Uu的有無，不易計數，因此不能判斷感染的嚴重程度。此次實驗中用到的固體培養基是上海同濟大學研制的新型固體培養基，在傳統培養基的基礎上增加血清含量，添加了細胞培養液(10%DMEM)促進支原體生長，縮短培養周期。但由于支原體菌落較小，無法肉眼觀察，需借助顯微鏡等儀器觀察，且雜菌污染率較高，有時會影響鏡下觀察，可能導致假陰性判斷。通過以上比較，固體培養基與梅里埃培養基各有優缺點，但梅里埃培養基可能更適用于臨床。

與液體培養法相比，梅里埃培養基檢測Uu的靈敏度(72.9%)明顯優于液體培養法(42.0%)。雖然梅里埃培養基有很多優點，但其價格昂貴，不適用于大樣本檢測與臨床檢驗。由于梅里埃培養法與液體培養法原理相似，如果對現有液體培養基進行一定改良，比如調整液體培養基內抗生素的種類及含量，改良液體培養基對Uu培養的效果，使其更適用于臨床及科研。

[1]Jalal H, Delaney A, Bentley N, et al. Molecular epidemiology of selected sexually transmitted infections[J]. Int J Mol Epidemiol Genet, 2013, 4(3):167-174.

[2]Xu XL, Chen LM, Liang LY, et al. Analysis of pathogens in 1 282 patients with genitourinary infection[J]. Chin J Microecol, 2005, 17(2):139-140. (in Chinese) 徐孝倫, 程力明, 梁流亞, 等. 1281例泌尿生殖道感染患者的病原體分析[J].中國微生態學雜志, 2005, 17(2):139-140.

[3]Guo AS, Li HL, Wang B, et al.Ureaplasmaurealyticumcausing genitourinary tract infection in different age groups of women and analysis of drug susceptibility[J]. Chin J Nosocomiol, 2013, 23(19):4838-4840. (in Chinese) 郭愛霞, 李紅林, 王兵, 等. 女性泌尿生殖道解脲支原體感染患者的年齡分布與藥敏分析[J]. 中華醫院感染學雜志, 2013, 23(19):4838-4840.

[4]Li YC, Wu SN.Mycoplasmainfections in female genitourinary tract and analysis of drug resistance[J]. Chin J Nosocomiol, 2013, 23(5):1209-1211. (in Chinese) 李軼春,吳紹男. 婦女泌尿生殖道支原體感染調查及耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志, 2013, 23(5):1209-1211.

[5]Ge P, Song YX, Zhang WY, et al. Detection and drug resistance ofMycoplasmacausing urogenital tract infections in 465 female patients[J]. Chin J Nosocomiol, 2012, 22(24):5664-5665. (in Chinese) 葛萍, 宋月星, 張文英, 等. 465例女性生殖道感染支原體屬檢測及耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志, 2012, 22(24):5664-5665.

[6]Diaz L, Cabrera LE, Fernandez T, et al. Frequency and antimicrobial sensitivity ofUreaplasmaurealyticumandMycoplasmahominisin patients with vaginal discharge[J]. MEDICC Rev, 2013, 15(4):45-47.

[7]Chen HX, Tao RX, Yang ZQ, et al. Liquid culture method in detection of mycoplasma from genitourinary tract: evaluation of effect[J]. Chin J Nosocomiol, 2011, 21(23):5092-5094. (in Chinese) 陳紅霞, 陶日新, 楊振強, 等. 液體培養法檢測泌尿生殖道支原體屬的效果評價[J]. 中華醫院感染學雜志, 2011, 21(23):5092-5094.

[8]Zhang HS, Han J. Analysis of false positive reasons ofMycoplasmaliquid culture method[J]. Lab Med, 2012, 27(4):316-318. (in Chinese) 張紅升, 韓晶. 支原體液體培養法假陽性原因探討[J]. 檢驗醫學, 2012, 27(4):316-318.

[9]Wang B, Zhao JW, Wang CX, et al. Comparison of two kinds ofMycoplasmaculture methods application and clinical significance[J]. Chin J Epidemiol, 2004, 25(12):1093-1094. (in Chinese) 王蓓, 趙季文, 王長嫻, 等. 兩種支原體培養基的應用比較及臨床意義[J]. 中華流行病學雜志, 2004, 25(12):1093-1094.

[10]Choe HS, Lee DS, Lee SJ, et al. Performance of Anyplex II multiplex real-time PCR for the diagnosis of seven sexually transmitted infections: comparison with currently available methods[J]. Int J Infect Dis, 2013, 17(12):e1134-e1140.

Effect evaluation of present liquid culture detection method forUreaplasmaurealyticum

ZHOU Liang-jia,LIAN Da-shuai,XU Kai,YIKE Lamu,PUQIONG Ciren,WU Jian-ru,CHEN Lu-si,YANG Tian,XIE Yan-xin,WANG Bei

(DepartmentofEpidemiologyandStatistics,SchoolofPublicHealth,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

To evaluate the effect of present liquid culture method in detection ofUreaplasmaurealyticum(Uu) on sensitivity, specificity, false positive rate, false negative rate and consistency rate, 63 cases of clinical cervical secretion specimens were detected parallelly by liquid culture, new solid medium and BioM rieuxMycoplasmaID2. As a result,Uupositive rate was 36.7%, 66.7% and 84.1% for liquid culture, BioM rieuxMycoplasmaID2 and solid medium, respectively. Taken solid culture medium as gold standard, the sensitivity of liquid culture method was low (42.0%), the false negative rate was high (58.0%), and the specificity was fair (90.0%). The sensitivity of BioM rieuxMycoplasmaID2 detection ofUu(72.9%) was better than liquid culture method (42.0%). In conclusion, as the false negative rate of present liquid culture method is too high, it should be improved to enhance the validity and reliability of mycoplasma detection, and to establish a more convenient and reliable method for detectingUu.

Ureaplasmaurealyticum; liquid culture method; new solid medium; BioM rieuxMycoplasmaID2

Wang Bei, Email: wangbeilxb@seu.edu.cn

國家自然科學基金(30872156),東南大學大學生科研訓練計劃(SRTP)項目(13422007)

王蓓， Email:wangbeilxb@seu.edu.cn

東南大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，南京 210009

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.004

R183.7

A

1002-2694(2015)01-0016-05

2014-03-12；

2014-08-30

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30872156), and the Southeast University Student Research Training Program (SRTP)(No.13422007)