間日瘧原蟲抗藥性研究進展

徐 馨，劉懷鄂，劉永華，楊照青

間日瘧原蟲抗藥性研究進展

徐 馨1，劉懷鄂1，劉永華2，楊照青1

瘧疾作為一種致死性很高的全球性寄生蟲病，一直被全世界所關注，瘧疾的控制也被列入全球三大公共衛生問題之一。由于瘧疾抗藥性的流行和蔓延，尤其是間日瘧抗性的快速傳播，使得瘧原蟲抗性的檢測、預測以及新藥的研發成為當前研究重點。針對這一系列問題，本文對當前間日瘧抗藥性檢測方法、分子機理以及熱點抗間日瘧藥物做一綜述。

間日瘧原蟲；抗藥性；研究進展

瘧疾是一種嚴重威脅人類健康的傳染病，每年有 3億 至 5億新發瘧疾病例和至少100萬人因感染瘧疾死亡。同時由于瘧原蟲抗藥性的產生和迅速擴散，致使全球瘧疾發病率和死亡率迅速回升，使全球瘧疾防治面臨嚴重困難，也嚴重威脅到我國人民身體健康和社會經濟發展。由于惡性瘧原蟲感染引起的癥狀比其它種類的瘧原蟲嚴重以及間日瘧原蟲體外培養體系的缺乏等原因，69%的瘧疾相關研究主要放在惡性瘧疾方面。長期以來，間日瘧原蟲引起的瘧疾被認為預后是良性的，對于間日瘧原蟲的研究并沒有引起學術界的關注。但作為4種瘧原蟲中最流行的種類之一，間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)的分布比惡性瘧原蟲更廣[1]，并且通過近期的研究發現間日瘧同樣是嚴重危及生命的重要寄生蟲病。由間日瘧原蟲引起的瘧疾給人類的健康、財富、繁榮帶來巨大壓力。然而，新藥的研發速度遠遠落后于瘧原蟲抗藥性的產生速度。因此間日瘧原蟲的抗藥性研究自然成為抗瘧治療中的重要環節。

1 間日瘧原蟲抗藥性檢測方法

1.1 體內測定 體內測定法按服藥后瘧原蟲清除的情況判斷，據觀察時間不同分1周法和4周法。按照世界衛生組織的分級標準[2]，抗性可分為3個等級。一級抗性(R1)定義為服藥后7 d內瘧原蟲無性體被清除，但在 28 d內瘧原蟲無性體又重新出現者。二級抗性(RII)為服藥后 48 h瘧原蟲無性體比服藥前減少 75%以上，但 7 d內瘧原蟲無性體不轉陰者。三級抗性(RIII)為服藥后48 h瘧原蟲無性體沒有減少到服藥前的 75%，或原蟲無性體數增加，隨后亦未見無性體原蟲轉陰者。

1.2 體外測定

1.2.1 微量測定法 WHO 推薦的Rieckmann體外微量測試法基于計數可發育為裂殖體的原蟲數目[3]。取0.2 mL 含蟲血樣，稀釋于1.8 mL培養基中，在測定板各井中依次加入50 μL含蟲血培養及混合液，在37 ℃恒溫箱內蠟燭剛培養，培養19～37.5 h。培養時，瘧原蟲密度超過80 000個/μL血時，用健康人“O”型血紅細胞稀釋至20 000～50 000個/μL血。再按上述方法操作，計數厚血膜中20個無性體原蟲范圍內3個核及以上的裂殖體數。同位素微量測試法基于檢測外源性核酸前體，同位素標記的次黃嘌呤摻入量。此外還有瘧原蟲乳酸脫氫酶分析，瘧原蟲乳酸脫氫酶及富組氨酸蛋白酶聯免疫反應等色度檢測方法[4-5]，以及近來發展的利用 SYBR Green Ⅰ等標記的熒光法和流式細胞儀法。最近，有文章表明，間日瘧的檢測ex-vivo 抗藥性測定，如果不事先過濾除去白細胞，由于本底干擾較大，Rieckmann體外微量測試法成功率高于SYBR GreenⅠ[6]。

1.2.2 分子測定 分子生物學技術的發展為確定瘧原蟲抗藥性的遺傳學基礎提供了新的研究工具。分子標記作為一項重要的補充工具，并不是體內抗藥性檢測的替代品，它適用于大規模篩查、評估及監測瘧原蟲抗藥性。目前廣泛應用于瘧原蟲抗藥性研究的分子標記為單核苷酸多態性 (SNP)，這是Lander E 于 1996 年提出的第3代 DNA 遺傳標記。DNA 芯片技術的日趨成熟使得 SNP 成為最重要最有效的分子標記。常用的實驗室技術還包括 PCR 擴增測序[7]、限制性片段長度多態性分析(RFLP)[8]等。但由于我們對間日瘧原蟲的抗藥性的機理知之甚少，目前明確的有針對性的抗藥性靶標依然很少，需要我們加大研究力度。

2 間日瘧原蟲抗藥性的分子機理

目前，對于間日瘧原蟲抗性的研究遠遠滯后落后于惡性瘧原蟲的抗性研究。在間日瘧原蟲的抗藥性關聯基因研究中，目前Pvdhfr和Pvdhps的點突變相似于惡性瘧原蟲的，與葉酸類藥物抗性相關的研究報道較為肯定[9-10]。Pvmdr1的拷貝數的增加與甲氟喹的抗性有關系[10]，這與惡性瘧原蟲的也極為相似。而氯喹的抗藥性卻一直不清楚。可以肯定的是，與惡性瘧原蟲不同的是，與Pvcrt-o的點突變沒有[9, 11-12]，可能與表達過量有關[10]，有研究認為與Pvmdr1的拷貝數的增加有關系[13]，但是更多的研究認為沒有關系，拷貝數增加只與甲氟喹的抗性有關系[11]。也有認為與Pvmdr1的 Y976F和 F1076L位點的點突變有關系[10]，但是卻沒有進一步得到其他研究的支持[11-12]。

3 針對間日瘧原蟲抗藥性的藥物研究

抗瘧藥物在人類與瘧原蟲幾千年的抗爭中發揮了極為重要的作用，但由于瘧原蟲抗藥性的迅速蔓延，多重耐藥蟲株的出現使得在很多瘧疾重災區,可供選擇的抗瘧藥物已十分有限，急需新藥的誕生。由于作為分布最為廣泛的間日瘧本身具有傳播快、易復發、難于治愈的特點，對新藥的研發提出了更高要求。在世界上大部分地區，由于惡性瘧原蟲對多種抗瘧疾藥物的廣泛抗性產生，青蒿素類藥物被確定為治療惡性瘧的一線藥物。為了保護青蒿素類藥物的敏感性，WHO推薦間日瘧的治療以氯喹-伯胺喹聯合為一線藥物。近70年來，氯喹-伯胺喹配伍依然是世界上大部分地區治療間日瘧疾的一線藥物。

氯喹(Chloroquine)作為最早發現和使用的最為有效的抗瘧藥物，挽救了大量人類瘧疾患者的生命和物質財富。但在大規模用于瘧疾治療后，瘧原蟲陸續對它產生抗藥性，并且抗性蟲株在全球范圍迅速播散。針對氯喹耐藥性的出現，新研發的WHO推薦用藥還包括氨酚喹(Amodiaquine)、甲氟喹(Mefloquine)。目前研究較熱的上市藥物復方磷酸萘酚喹片(Arco)，在相關實驗中證實一次服藥可以擁有更長的有效血藥濃度控制時間和較少的副作用。自從 1989年在巴布亞新幾內亞地區發現首列氯喹抗性株以來[14]，多個地區相繼發現抗性株[10,15]。在一些氯喹高抗性地區，比如索羅門群島、瓦努阿圖、巴布亞新幾內亞、印度尼西亞等地區，由于敏感性降低的蟲株量超過30%， ACT(Artemisinin-based Combination Therapy，ACT)方案已經取代氯喹治療方案[15]。

青蒿素(Artemisinin)及其衍生物是一種具有與含氮雜環的奎寧衍生物完全不同的分子結構的含氧基團的新型倍半萜內酯類化合物。在瘧疾治療的相關實驗證實青蒿素類藥物比起奎寧類化合物具有高效、低毒的特點。自從1989年首次公開報道關于間日瘧原蟲對氯喹產生抗性以來學術界陸續開始研發除含氮雜環類化合物的新藥物。目前WHO推薦的主要藥物除青蒿素外還包括蒿甲醚(Artemether)、青蒿琥酯(Artesunate)、雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin)、蒿乙醚(Artemotil)。青蒿素類藥物雖然未有耐藥性報道，但是惡性瘧原蟲的體外試驗顯示敏感性在逐漸降低，對于易發生耐藥的間日瘧產生抗性問題更不容忽視。由于可供選擇的抗瘧藥物種類有限，加之臨床治療過程中的不規范使用，加速了蟲株抗性的產生，縮短了藥物的有效期，加劇了新藥研發迫切性。

伯氨喹是目前WHO推薦治療方案中防止間日瘧復發的唯一用藥。由于氯喹和青蒿素類藥物只能作用于紅細胞內期，而只有伯胺喹可以殺滅紅細胞外期，所以為了間日瘧防治復發，前者與后者聯用，才能取得好的效果。但是，人們除了發現間日瘧原蟲的氯喹抗性外[16-19]，還發現伯氨喹的抗性，巴西已發現24.5%的病例用伯氨喹防止復發失敗[20]。可喜的是，目前他非諾喹(Tafenoquine)已經進入臨床3期研究，取得好的效果，人們多了一些選擇。在這項考證他非諾喹有效性和安全性的多中心雙盲臨床藥物試驗中發現，300 mg(89.2%)和600 mg(91.9%)的單次劑量他非諾喹聯合氯喹治療間日瘧對間日瘧復發率的控制效果明顯好于單用氯喹(37.5%)和氯喹聯合伯氨喹組(77.3%)，而副作用未見增加[15]。這些報告無不敦促人們尋找新的有效治療途徑。聯合用藥便是途徑之一，聯合用藥因為不同藥物作用的靶標不同，因此效果優于單獨使用，則可以提高治療效果或者延緩瘧原蟲產生抗性。

目前雖然已經擁有了療效比較明確的包括ACT、氯喹聯合伯氨喹在內的多種抗瘧方案，但由于瘧原蟲抗藥性的迅速蔓延,特別是多重抗藥性瘧疾的不斷擴散,使得我們在很多瘧疾重災區的抗瘧治療捉襟見肘，可用藥物日漸匱乏。如何能夠簡單準確的檢出、預測瘧原蟲的抗性，快速研發有出效的藥物是保證全球抗瘧策略成功的關鍵。尤其對于分布面積最為廣泛的間日瘧，由于過去認識的偏差和體外培養條件的限制，相關的研究還處于初期階段，還有很多工作需要繼續探索與努力。

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Drug resistance ofPlasmodiumvivax

XU Xin1,LIU Huai-e1,LIU Yong-hua2,YANG Zhao-qing1

(1.DepartmentofParasitology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2.YunnanRuiliCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruili678600,China)

As a high lethality and global parasitic disease, malaria has been the worldwide attention, and the control of malaria has been listed as one of the world’s three major public health problems. Prevalence and spread of drug-resistance, especially the rapid spread of resistance, becomes the research focus ofPlasmodiumdrug-resistance detection, prediction and development of new drugs forPlasmodiumvivaxmalaria. According to these series problems, the currentPlasmodiumvivaxmalaria drug resistance test method, the molecular mechanism and hot spots ofPlasmodiumvivaxmalaria drugs were reviewed in this article.

Plasmodiumvivax; drug resistance; review

Yang Zhao-qing, Email: zhaoqing92@hotmail.com

國家自然科學基金(No.31260508;No.U1202226);教育部高等學校博士學科點專項科研基金(No.20125317110001)

楊照青，Email：zhaoqing92@hotmail.com

1.昆明醫科大學寄生蟲學教研室，昆明 650500； 2.云南省瑞麗市疾病預防控制中心, 瑞麗 678600

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.016

R382.3

A

1002-2694(2015)01-0074-03

2014-03-07；

2014-10-02

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31260508 and U1202226) and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20125317110001)