抗流行性乙型腦炎病毒藥物的研究進展

蔡雨函,朱 玲,2,周遠成,楊文宇,徐志文,2

抗流行性乙型腦炎病毒藥物的研究進展

蔡雨函1,朱 玲1,2,周遠成1,楊文宇1,徐志文1,2

流行性乙型腦炎(Japanese Encephalitis，JE)是由黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivirus)流行性乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的，在自然界中主要以豬為宿主，經蚊傳播的一種蚊媒性人獸共患傳染病。該病主要流行于亞洲及西太平洋地區，嚴重威脅著人類健康，已成為人類腦炎疾病最主要的病因之一，并影響養豬業的發展，引起了世界性的廣泛關注，因此，流行性乙型腦炎的防治研究有著重要的實際應用意義。到目前為止，尚無治療流行性乙型腦炎特效藥面市，但對抗流行性乙型腦炎病毒藥物的研究已有一定的進展，而我國在這方面的系統介紹較少，本文就近10年來抗流行性乙型腦炎藥物及其作用機制的研究進展做一綜述，旨在為流行性乙型腦炎的預防和治療提供參考。

流行性乙型腦炎；抗病毒；藥物

流行性乙型腦炎(Japanese Encephalitis，JE) 簡稱乙腦，是由黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV) 引起的一種嚴重威脅人畜健康的急性中樞神經系統傳染病[1]。該病主要分布于亞洲和西太平洋地區，以中國及東南亞地區流行最為嚴重。目前，JE已經擴散到西太平洋的一些島嶼，而我國除西藏、青海、新疆外，其他地區均有乙腦流行，約占世界60%的人口(近30億)生活在JEV流行地區[2]。據WHO估計，每年全世界JE發病人數為3～5萬人，其中造成1～1.5萬人死亡，但仍有大量乙腦病例沒有得到及時報道和列入統計數據，保守估計每年全世界 JE 發病人數達到7.5 萬[3]。JE 也是養豬業最重要的繁殖障礙性疾病之一，可引起母豬流產、木乃伊胎、弱仔，公豬則表現為睪丸炎，給養豬業帶來嚴重的經濟損失[1]。因此，乙腦的防治研究有著重要的實際應用意義。

當前疫苗免疫預防仍是控制乙腦流行的主要措施，但疫苗本身具有一定的局限性，而且病毒的突變和種系的多樣性以及考慮到病毒與宿主的緊密關聯性等阻礙了疫苗的應用。此外，養殖業中以疫苗預防為主，不提倡JE 的治療，但是對于已感染JE的人群，藥物治療才是根除乙腦病毒感染最有效的方法，因此，尋找具有預防和治療作用的抗乙腦藥物就顯得尤為重要和緊迫。從過去到現在病毒學家一直都在尋找可以有效防治JEV的藥物，雖然當前還未有治療乙腦的特效藥面市，但是許多研究已經有了一定進展。目前我國在抗乙腦病毒藥物方面系統介紹的較少，本文就最近10年獲得的具有抗乙腦效果的藥物及其作用機制做一綜述，并按照藥物性質進行了簡單的分類，旨在為進一步研究抗病毒途徑，研發出特效的治療藥物提供新的思路和方向。

1 人工合成的抗病毒藥

1.1 核酸靶向治療劑

1.1.1反義寡核苷酸 反義寡核苷酸技術是利用堿基互補原理，與靶mRNA或靶DNA互補配對，抑制或封閉該基因的轉錄和表達，或誘導RnaseH識別并切割mRNA，使其喪失功能。因此，通過反義分子定向針對病毒基因組來阻止病毒復制不失為一種有效治療JEV的方法。嗎啉反義寡核苷酸是一種不帶電的反義寡聚物，能抑制細胞內mRNA的剪接過程，從而抑制基因的表達；同時具有良好的穩定性、溶解度和細胞滲透性[4]。Anantpadma M 等[5]通過建立細胞模型及小鼠模型來評估肽共軛磷酸二胺嗎啉低聚物(PPMOs)抗病毒活性。結果顯示針對乙腦3′端環化序列(3′CSI)的PPMOs在Vero(上皮)、Neuro2A(神經元)及J774E(巨噬細胞)中具有顯著的抗病毒活性。PPMOs的抗病毒效果在體內也被證實。1周齡小鼠腦內感染致死劑量的JEV后，連續5 d每12 h注射20 mg/kg的PPMOs，對小鼠有60%～80%的保護率，而且在用藥第2 d在小鼠腦組織中已經檢測不到JEV。Nazmi A等[6]也通過小鼠試驗證明嗎啉具有神經保護作用，有效增加了動物的存活率。結果表明，嗎啉反義寡核苷酸具有顯著抗乙腦活性。

1.1.2 酶制劑 脫氧核酶(DNAzymes,Dzs)是一類具有催化活性的單鏈DNA分子，兼具反義寡核苷酸的反義抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等雙重優勢，而且穩定性好。Appaiahgari M B等[7]針對JEV 3′-NCR合成Dz 3Dz，并在其3′端加上[poly-(G)10](3DzG)后證明具有顯著的抑制病毒在細胞及鼠腦中增殖的能力。這也是第一次在體內試驗中應用Dzs治療病毒感染獲得成功，為Dzs在病毒感染治療中的應用帶來了新的希望。

先前研究表明牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana ribonuclease，RC-RNase)具有抗腫瘤活性，Lee Y 等[8]報道其還具有抗乙腦活性，進一步研究發現它是通過活化caspase-3、caspase-8及caspase-9 活性誘導被感染JEV BHK-21細胞凋亡，從而抑制病毒增殖。

1.1.3 SiRNA/ShRNA RNA 干擾是一種由雙鏈RNA介導的在轉錄后水平關閉相應基因表達的序列特異性基因沉默機制，由Fire等于1998年在研究秀麗線蟲基因組計劃時首次闡明。目前已被廣泛用于傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域，是一種有希望的抗病毒感染手段。許多研究已經報道siRNA或shRNA能在體內、體外抑制JEV 的復制[9-12]。目前JEV分有5個基因型，但之前研究的siRNA沉默機制主要是針對JEV 基因Ⅲ型發揮效應，由于5種基因型病毒基因之間存在較高的遺傳變異，所以能抑制基因Ⅲ型的siRNA可能并不能抑制其它基因型病毒的復制。Wu Z 等[13]構建了一個單一的microRNA-like 的多順反子，利用聚合酶Ⅱ啟動子同時表達9個針對JEV 保守序列設計的siRNA，結果顯示此多順反子能顯著降低所有基因型病毒含量。Kumar P等[14]報道針對JEV 和西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)共同保守的序列合成的siRNA能同時抑制這兩種病毒感染小鼠。這個結果清楚的表明，在設計藥物的靶位點時，一個單一的siRNA可以抑制多種病毒的混合感染，從而可以同時治療有共同癥狀的急性病毒感染。

1.2 核酸類似物 利巴韋林(ribavirin)是于1972年合成的核苷類廣譜抗病毒藥。最近研究表明，該藥的抗病毒機制除了抑制磷酸肌苷脫氫酶(IMPDH)和調節免疫外，它還可以通過RNA聚合酶結合于病毒基因組中，導致病毒基因組出現致命的基因突變，直接產生抗病毒效應[15]。許多體外[16-17]及動物實驗[18]證明利巴韋林對蟲媒病毒(包括JEV及WNV)的抗病毒效果是非常明顯的。在某些南亞國家，已經有用利巴韋林治療乙腦的經驗[19-21]。不過，Kumar R等[21]報道當兒童感染JEV后，口服利巴韋林并不能降低早期致死率?？诜邉┝康睦晚f林及利用其它給藥途徑治療乙腦的效果還需要進一步研究。

1.3 細胞因子類 已有研究報道干擾素(interferon)的作用機制是通過作用于健康組織的細胞后產生抗病毒蛋白阻礙病毒復制，保護宿主不遭病毒破壞，從而抑制病毒播散，同時可調節免疫，增強T、B 細胞活性，促進細胞的吞噬作用。近年研究表明乙腦的發病機制為病毒對神經組織的直接侵襲作用和免疫損傷。因此, 用干擾素治療乙腦在理論上是可行的。目前，許多體外、動物實驗及臨床實驗已經證明干擾素確有抗乙腦活性[16,18,22-23]。Yang T 等[24]報道I型干擾素是針對NS5蛋白阻礙JEV 復制。

JEV感染宿主后會快速產生炎癥反應，TNFa的增加會促進病毒的增值，逃避宿主防御，從而引起病人的預后不良[25-26]。因此，能抑制TNFa的復合物可能會減少JEV感染的嚴重程度。己酮可可堿(Pentoxifylline)是已知的抗腫瘤壞死因子，多項調查研究表明，己酮可可堿對一系列的RNA和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性。Sebastian L 等[27]通過體內及體外試驗研究顯示己酮可可堿以劑量依賴的方式抑制JEV在細胞中增殖，同時能保護小鼠免受致死性JEV的攻擊。其作用機制有可能是對病毒的組裝和/或釋放產生作用。

1.4 黃酮類化合物 最近研究表明NS1’蛋白在乙腦病毒神經侵襲力方面發揮巨大的作用，而該蛋白是由位于NS1 C端，NS2基因下游的假結結構(pseudoknot structure)引發的α-1核糖體讀碼框位移而產生。這個假結結構的穩定性與核糖體移碼效率有關[28-29]，小分子緊密結合這一序列會干擾該假結結構的穩定性，從而影響NS1’蛋白的形成，因此此位點可能是潛在的設計抗乙腦病毒藥物的靶點。Zhang T 等[30]研究表明山奈酚和黃豆苷均能抑制乙腦病毒在BHK-21細胞中增值，進一步發現其作用機制即是通過與fsRNA(frameshift site RNA)結合從而使病毒失活。

1.5 抗生素類 米洛環素(Minocycline)是廣譜抗生素-四環素成員，已報道其具有抗蟲媒病毒活性。Mishra M等[31]進一步研究米洛環素在體外試驗中抗乙腦病毒作用。結果顯示，米洛環素能降低神經細胞凋亡，細胞感染JEV 9 d后，病毒滴度大幅度降低。米洛環素還具有抗氧化作用，能顯著改善由乙腦感染引起的氧化應激[32]；同時也能保護血腦屏障，阻止JEV的擴散[33]。

1.6 其它 已有報道CSA(cyclosporin A)具有抗乙腦活性，Kambara H 等[34]研究表明CSA是通過抑制CypB與NS4A相互作用抑制病毒復制。內質網的葡萄糖苷酶抑制劑能夠對一些內質網出芽病毒包括JEV發揮抗病毒效應[35]。Sehgal N 等[36]發現用過氧化物酶體增殖物激活受體α激動劑-非諾貝特(Fenofibrate)預處理小鼠4 d，能保護80%小鼠免受JEV致死性病毒的攻擊，因此可以作為一種預防用藥。

2 天然藥物中獲得的抗病毒藥

天然產物特別是植物一直是新藥先導化合物和新藥發現的重要資源，目前大約有25%的新藥源于植物，從中篩選有效成分也成為當前抗病毒新藥研究的熱點。

2.1 黃芪、連翹 洪文艷等[37-38]研究表明黃芩提取物及連翹濃縮煎劑在體外細胞模型中有一定的抗乙腦病毒感染作用，但對JEV無直接滅活作用，作用機理可能是通過干擾病毒對細胞的吸附及抑制病毒在細胞內的復制增殖，且作用效果與用藥劑量呈正相關的劑量效應依賴性。

2.2 板藍根提取物 Chang S等[39]通過體內及體外試驗分別研究了板藍根提取物(乙酸乙酯提取物和甲醇提取物)及其相關化學組成物(靛藍、靛玉紅、色胺酮、腺苷、白樺脂醇、羽扇豆醇及2-苯并惡醇)對乙腦的抑制作用。結果顯示板藍根提取物中有潛在的抗乙腦病毒作用的成分，其中，靛玉紅表現出更高的抗病毒活性，其作用機制可能是干擾病毒對細胞的吸附。

2.3 藻類提取物 近年研究表明硫酸多糖無論在體外還是體內，都顯示了不同程度的抗病毒活性，尤其是與目前使用的其他抗病毒藥物相比，因其細胞毒作用較小而得到廣泛的關注。已有研究報道硫酸多糖具有抗乙腦活性。Chiu Y等[40]發現從石莼中提取的硫酸多糖(sulfated polysaccharide)能抑制JEV感染Vero細胞。在動物試驗中，JEV感染 C3H/HeN小鼠后在第15 d會出現神經行為的異常情況，于第17 d死亡。但是在感染JEV前用從石莼提取的硫酸多糖預處理能延遲發生的時間，因此能阻止小鼠死亡。其作用機制是通過阻止病毒吸附而發揮作用。Kazowski B等[41]報告從江蘺屬和海菜中提取的新的低程度聚合的硫酸糖(low-degree-polymerisation sulfated saccharides)比未消化的多糖(PS)抗病毒能力更強，其原因可能與低DP硫酸糖比PS更好吸收有關。

2.4 喜炎平注射液 喜炎平注射液是由穿心蓮總內酯(穿心蓮甲素、乙素、丙素、丁素)、穿心蓮新苷、脫水穿心蓮內酯等成分組成，經過磺化工藝處理，提高了有效成分穿心蓮內酯的純度，可減少臨床使用中藥注射劑的毒副作用。其對多種病毒有滅活作用，還具有抗病毒、抗菌、抗炎解熱，增強免疫，增加腎上腺皮質功能等作用。涂晉文等[42]通過臨床觀察結果表明，喜炎平注射液治療能明顯縮短體溫下降時間和病程時間，改善昏迷和抽搐等癥狀。而且在治愈率和好轉率上都大于西藥對照組。喜炎平注射液因其安全有效，副作用少，有望成為新一代治療乙腦的藥物。

2.5 牛蒡子甙元 牛蒡子甙元(Arctigenin)具有抗氧化，抗炎，抗病毒作用。據報道，用牛蒡子甙元治療感染JEV的小鼠效果顯著，能明顯降低病毒誘導的神經元凋亡、小膠質細胞的活化及活化的半胱天冬酶活性。報道還稱牛蒡子甙元能直接作用于大腦細胞，這樣更利于治療乙腦[43]。

2.6 酚類化合物 迷迭香素(rosmarinic acid)是發現于唇形科草本植物中的一種酚類化合物，具有抗炎及抗氧化功能。Swarup V等[44]報道在建立的小鼠模型中，迷迭香素能抑制JEV的復制，而且能改善由小膠質細胞引發的繼發反應。姜黃素(Curcumin)是從姜黃中提取的酚類化合物，已被證明在體外感染JEV研究中具有抗病毒效應，它可能通過降低細胞內活性氧水平，減少促凋亡信號分子，恢復細胞膜完整性，調節相關應激蛋白來發揮作用[45]。

3 展 望

目前臨床上針對感染乙腦的人群，還是以積極的對癥治療和細致的臨床護理為主，特別是對于重癥乙腦患者，高熱、抽搐、呼吸衰竭這三關的護理是降低病死率和減少后遺癥的關鍵。但是綜合的治療方法并不能有效治愈患者，目前全世界由乙腦引起的死亡率還是很高，通過特效藥治療加上適當的臨床護理才是治療乙腦最有效的辦法。近年來有關抗乙腦藥物的研發是國際上生物學、醫學領域研究的熱點，經過病毒學家的不懈努力，已經發現多種藥物具有抗乙腦活性，但是這些藥物作用效果評估主要停留在動物模型、細胞和分子水平上，臨床用藥的效果評價較少，因此，還需要進一步進行療效及相關藥理學研究，確證該藥物能夠治療感染乙腦的人群及動物，能夠將其投入到臨床應用中。

總結以上抗乙腦藥物的作用機制顯示，其研究策略主要有以下3點：抑制病毒蛋白或基因功能、增強機體抗病毒免疫功能及作用于宿主細胞中參與病毒生命周期的“幫兇”分子。在臨床上，利用不同藥物的抗病毒機制及藥物間協同作用，將不同藥物聯合使用能夠提高藥物的治療效果，更有效地抑制病毒復制，降低藥物使用劑量，降低毒性和可能出現的藥物抗性。因此，聯合用藥將是乙腦臨床治療的發展方向。我國的植物資源極為豐富，具有應用植物藥進行疾病防治的悠久傳統。目前已經發現許多從植物中提取的產物具有抗乙腦的作用，應該進一步重視從植物源中尋找新的抗JEV藥物或先導化合物的開發研究。RNAi是近幾年新興起的研究熱點，由于其特異性高，安全性好，在抗病毒研究領域具有良好的應用前景，如果在理論和技術上加以完善，siRNA可能成為抗乙腦病毒特效藥物。MicroRNA( MiRNA)是 21 世紀生命科學研究的重大發現，其作用機制與siRNA相似，已有大量研究證明MiRNA可以對病毒起到調節作用，故可以發展成為一種新型的抗病毒藥物，而目前關于乙腦MiRNA的研究國內外還是空白，因此這也是今后抗乙腦藥物研究的一個方向。隨著生物工程和制藥技術的飛速發展，乙腦的治療一定有很好的前景，安全、高效的抗JEV藥物將很快投入到臨床應用。

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1986年，我在山東師范大學教育系讀研究生時，就系統地研究了捷克教育家喬治·洛扎諾夫（Georgi Lozanov）的暗示教學法及蘇聯教育家沙塔洛夫的綱要信號圖示教學法。1990年下半年，我與山東省鄒平縣教研室和淄博市臨淄區教研室合作，首先在初中生物、歷史、地理、數學教學中推廣綱要信號圖示教學法，在中小學的語文、英語、數學教學中推廣暗示教學法，簡稱“兩種愉快教學法實驗”。

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Research advances in antiviral drugs for Japanese encephalitis

CAI Yu-han1,ZHU Ling1,2,ZHOU Yuan-chen1,YANG Wen-yu1,XU Zhi-wen1,2

(1.AnimalBiotechnologyCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China;2.KeyLaboratoryofAnimalDiseasesandHumanHealthofSichuanProvince,Ya’an625014,China)

Japanese encephalitis (JE), an insect-borne zoonotic infectious disease, is caused by Japanese Encephalitis Virus (JEV) that belongs to the genusFlaviviruswithin the familyFlaviviridae, and the most important hosts of which in nature is pigs. This disease occurs mainly in Asia and the Western Pacific region, and has become one of the most serious encephalitis diseases which threats to human and affects the development of pig farming industry. It causes great attention in global scale, therefore, it is of great actual significance to study the prevention and control of JE. So far, there is no specific antiviral drug available to treat JE, however, research in antiviral drugs for JE has some progress. The report on the antiviral drugs for JE is quite few in China. In this paper, we briefly review advances on the antiviral drugs for JE and its mechanism in the past 10 years, aiming at serving as a guide for prevention and control of this disease.

Japanese encephalitis; antiviral; drugs

Xu Zhi-wen, Email:abtcxzw@126.com

徐志文，Email: abtcxzw@126.com

1.四川農業大學 動物生物技術中心，雅安 625014； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，雅安 625014

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.017

R978.7

A

1002-2694(2015)01-0077-06

2014-02-19；

2014-10-05

四川農業大學優秀碩士論文培育基金(YS2014006)；四川省科技支撐計劃項目(2012NZ0001)

Supported by the Excellent Master Dissertation Fostering Foundation of Sichuan Agricultural University (No. YS2014006), and the Sichuan Provincial Science and Technology Support Program (No. 2012NZ0001)