間隔區寡核苷酸分型技術用于結核分枝桿菌多重感染的初步研究

吳小翠,王曉櫻,魏劍浩,劉海燦,趙秀芹,夏遠志,樓永良,呂建新,萬康林,4

間隔區寡核苷酸分型技術用于結核分枝桿菌多重感染的初步研究

吳小翠1,2,王曉櫻3,魏劍浩1,2,劉海燦2,4,趙秀芹2,4,夏遠志1,2,樓永良1,呂建新1,萬康林1,2,4

目的 初步評價間隔區寡核苷酸分型(Spoligotyping)技術在鑒定結核分枝桿菌多重感染中的應用。方法 選取結核分枝桿菌臨床分離株，5 μm孔徑濾膜過濾法制備單個細菌菌懸液，平板接種37 ℃培養，選取生長良好的單個菌落培養增菌，提取基因組DNA，Spoligotyping進行基因分型鑒定，比較臨床分離株與相應的單克隆分離株的分型結果。結果 共選取32株結核分枝桿菌臨床分離株，獲得306個單克隆分離株。Spoligotyping分型鑒定結果顯示30株結核分枝桿菌臨床分離株與相應的單克隆分離株的分型結果一致，2株臨床分離株的單克隆分離株呈現了多種基因型，多重感染率為6.25%。結論 Spoligotyping可用于快速，有效地區分結核分枝桿菌多重感染。

結核分枝桿菌；間隔區寡核苷酸分型；多重感染

近年來，隨著對結核病感染傳播機制研究的深入，人們對結核分枝桿菌的多重感染有了更多的認識。結核病的多重感染是指在結核分枝桿菌病人體內同時或先后感染2種或2種以上的不同基因型的結核分枝桿菌或不同種的分枝桿菌[1]。有關結核分枝桿菌多重感染的報道也越來越多。Dorío等人采用限制性片段長度多態性(IS6110-RFLP)在2歲的原發性感染的兒童體內分離出多種結核分枝桿菌[2]。Richardson等人采用IS6110-RFLP技術發現在高發病率地區，2.3%的病人存在結核分枝桿菌多重感染[3]。Chaves等人采用IS6110-RFLP技術發現在HIV合并結核感染的患者中存在結核分枝桿菌多重感染[4]。多重感染的研究對結核病的感染傳播機制、治療、疫苗、分子流行病學研究等方面有重要的意義。

IS6110-RFLP是一種以IS6610為基礎的結核分枝桿菌分型的標準方法，但是該方法操作復雜，重復性差，實驗結果不易進行實驗室間比較[5]。近10年，以PCR為基礎的Spoligotyping因其經濟，快速，簡便，易于標準化，被廣泛應用于結核分枝桿菌的分型鑒定。Spoligotyping是基于結核分枝桿菌直接重復區(DR)的多態性而建立的一種方法[6]。它通過PCR擴增DR區，將標記的擴增產物與固定在Biodyne C膜上的寡核苷酸探針進行雜交，通過雜交信號的檢測得到特異性的結果。

本研究采用Spoligotyping技術對32株內蒙的結核分枝桿菌臨床分離株的306個單克隆標本進行基因分型，旨在證實我國結核分枝桿菌多重感染的存在，探討Spoligotyping在結核分枝桿菌多重感染研究中的應用。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 32株結核分枝桿菌臨床分離株隨機挑選于內蒙古自治區結核病防治所[7]從內蒙地區2011年結核病患者分離獲得菌株，由中國疾病預防控制中心傳染病所結核室擴大培養及保存。標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核室提供。

1.2 單克隆標本的分離 將32株結核分枝桿菌保存的菌株接種于L?wenstein-Jensen(L-J)固體培養基，挑取對數生長期的細菌，刮取L-J培養基上大部分培養物，采用TE緩沖液稀釋、研磨，5 μm孔徑濾膜過濾法制備單個細菌菌懸液，L-J固體培養基平板接種培養，4周后，每株菌中隨機挑取10個生長良好的單克隆菌落，其中有5株臨床分離株的單克隆菌落數不足10個，故單克隆標本數少于10個；32株結核分枝桿菌共分離306個單克隆菌落，置于500 μL生理鹽水中形成菌懸液。再將單菌落懸液重新接種于L-J固體培養基上培養4至6周后，收集全部菌落于100 μL TE緩沖液中，沸水浴15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清置于-20 ℃保存。

1.3 間隔區寡核苷酸分型(Spoligotyping) 采用Spoligotyping分型技術對32株結核分枝桿菌臨床分離株及其單克隆標本進行基因分型。Spoligotyping的操作按照Kamerbeek等人建立的Spoligotyping的標準化程序進行[6]。具體方法為：①PCR擴增：PCR擴增整個DR區。引物DRa：CGTTTTGGGTCTGACGAC,5′端生物素標記；DRb:CCGAGAGGGGACGGAAAC。PCR擴增條件為：96 ℃ 3 min后；96 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s，35個循環；72℃ 10 min。②固定有間隔區寡核苷酸探針的Biodyne C膜的制備：Biodyne C膜具有Van Embden等[8]推薦的43個共價結合的寡核苷酸探針，每個寡核苷酸對應DR區位點間一個唯一的間隔區序列。其中37個間隔區序列來源于H37Rv標準株的DR區序列，其余的來源于M.bovisBCG的DR區序列。 先用新鮮配置的16% EDAC孵育膜15 min使膜活化，再用蒸餾水洗凈。在Miniblotter凹槽中平行加入150 μL用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀釋的0.125 μm寡核苷酸溶液，室溫孵育1 min后，依次吸出寡核苷酸溶液，取出膜，用0.1 mol/L NaOH孵育10 min。將膜用2×SSPE/0.1%SDS于50 ℃洗膜10 min，再用20 mmol/L EDTA室溫洗膜15 min,密封于塑料袋中置于4 ℃保存備用。③PCR產物的雜交與檢測：用2×SSPE/0.1% SDS于50 ℃洗膜5 min，將膜置于Miniblotter中，方向與制備雜交膜垂直。用150 μL 2×SSPE/0.1% SDS稀釋20 μL PCR產物，100 ℃變性10 min。將150 μL稀釋的PCR產物加到凹槽中，50 ℃雜交60 min。取出膜，用2×SSPE/0.5% SDS在55 ℃洗膜2次，每次10 min。用2.5 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素加到10 mL 2×SSPE/0.5% SDS中，42 ℃孵育膜30 min。洗膜后將雜交的DNA用地高辛/生物素雜交檢測試劑盒檢測，X光片曝光5 min。膜清洗后可反復使用。

1.4 數據分析 對Spoligotyping的43個間隔區雜交結果指紋圖譜進行分析，結果以二進制表示，錄入EXCEL，與數據庫SpolDB4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/index.jsp)比對分析，從而確定基因型。并將來源于同一個臨床分離株的單克隆標本結果進行比對，如有不同，則為多重感染菌株。用BioNumerics (Version 5.0)軟件對確定為結核分枝桿菌多重感染株的單克隆標本進行聚類分析。

1.5 質控 將H37Rv和生理鹽水分別作為陽性對照和陰性對照，每個臨床分離株的單克隆標本均在同一時間完成Spoligotyping檢測，如果為多重感染菌株，重復試驗，檢測是否為實驗室污染造成。

2 結 果

2.1 臨床分離株Spoligotyping結果 32株結核分枝桿菌臨床分離株Spoligotyping指紋圖譜，表現出7種基因型(表1)。其中27株均為北京家族株，包括26株典型的北京家族株(35～43之間的9個間隔區均為陽性)和1株非典型北京家族株(35～43之間的9個間隔區至少有3個為陽性)，剩余的5株均為獨特基因型，分別為T2家族，T1家族，MANU2家族和兩種新的Spoligotyping基因型，各1株(在SpolDB4.0數據庫中無匹配結果)。

2.2 單克隆株Spoligotyping結果 實驗編號為1到30的30株(93.75%)結核分枝桿菌臨床分離株的單克隆株Spoligotyping指紋圖譜與相應的臨床分離株一致，實驗編號為30和31的2株(6.25%)結核分離株臨床分離株的單克隆株出現不止一種的Spoligotyping指紋圖譜(表1)，為了驗證實驗結果的可靠性，重復實驗，結果一致，排除了污染的可能，表明這2株臨床分離株中存在不同基因型的菌株，確定為多重感染株。經BioNumerics聚類分析，其中1株臨床分離株的10個單克隆標本，分為兩種基因型(圖1)，有9個單克隆標本表現為新的Spoligotyping基因型，與臨床分離株結果一致，1個單克隆標本表現為北京家族株，分別為90%和10%(表1)；而另一株臨床分離株中的10個單克隆標本可分為3種基因型(圖2)，有3個單克隆標本與臨床分離株結果一致，表現為MANU2家族，5個單克隆標本為北京家族，2個為新的Spoligotyping基因型，分別占30%、50%和20%(表1)。

3 討 論

為了探討Spoligotyping在結核分枝桿菌多重感染中的應用，本研究通過對32株結核臨床分離株的單克隆標本進行Spoligotyping分型，證實在2株臨床分離株中存在不止一種基因型，屬于多重感染，說明Spoligotying可用于區分結核分枝桿菌多重感染。

結核分枝桿菌多重感染的研究使人們更加深刻地認識到結核分枝桿菌感染的復雜性。目前，仍然缺乏對結核分枝桿菌多重感染模式的研究。結核分枝桿菌多重感染可能是同時感染多種不用基因型的結核分枝桿菌，也有可能是初次感染一種結核分枝桿菌為潛伏性感染后，再次感染另一種結核分枝桿菌引起癥狀。多重感染發現提示機體感染一種結核分枝桿菌后可能對另一種結核分枝桿菌無法提供有效的免疫保護，這對于結核分枝桿菌疫苗的研究和開發有重要意義。有研究已證明，多重感染與同一病人結核分離株耐藥表現發生改變有關[9]，這有助于制定有效的結核病的防控和治療策略。

Note:※The clinicalM.tuberculosisisolate and corresponding had same spoligotype;

※※The spoligotype description binary of original clinical isolate which was proved to be multiple infections.

Spoligotyping技術已經被廣泛應用于結核分枝桿菌的分型。本研究采用Spoligotyping技術對隨機選取的32株結核分枝桿菌臨床分離株的單克隆標本進行分型，有2株(6.25%)臨床分離株出現了多種Spoligotyping指紋圖譜，證明Spoligotyping可檢測出結核分枝桿菌多重感染的存在。且Spoligotyping與IS6110-RFLP相比，經濟、快速，操作簡單，易于標準化，結果易讀可靠，更易于推廣。

結核分枝桿菌多重感染可能是廣泛存在的現象，但關于結核分枝桿菌多重感染的研究仍然不足，缺乏深層次的認識。本研究建立了快速，有效的鑒定結核分枝桿菌多重感染的Spoligotyping技術，但仍存在一定的局限性。臨床分離株的數目和單克隆標本數可能在一定程度上降低了多重感染的檢出率。要掌握結核分枝桿菌多重感染的感染率，仍然需要更多的研究。同時，可與多位點可變數量串聯重復序列分析(MLVA)技術聯合應用于結核分枝桿菌多重感染的研究。

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《中國人獸共患病學報》已標注數字對象唯一標識符

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DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.yyyy.nn.zzz

其各字段釋義：“10.3969”為中文DOI注冊機構分配給中國人獸共患病學報的統一前綴；“cjz”為中國人獸共患病學報(Chinese Journal of Zoonoses)縮寫；“j”為journal縮寫，代表信息資源類別為期刊；“issn.1002-2694”為國際標注連續出版物號(ISSN)；“yyyy”為4位出版年份；“nn”為2位期號；“zzz”為3位本期論文流水號。

《中國人獸共患病學報》編輯部

Multiple infections ofMycobacteriumtuberculosiswith spoligotyping

WU Xiao-cui1,2,WANG Xiao-ying3,WEI Jian-hao1,2,LIU Hai-can2,4,ZHAO Xiu-qin2,4,XIA Yuan-zhi1,2,LOU Yong-liang1,LU Jian-xin1,WAN Kang-lin1,2,4

(1.SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl/NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.DepartmentofPathophysiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForrensicMedicine,SichuanUniversity/CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China)

We assessed the application of spacer oligotyping (Spoligotyping) for identifying the multiple infections ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) preliminarily in this study. ClinicalM.tuberculosisisolates were randomly selected and prepared to single colony suspensions by filtration method with 5 μm pore diameter membranes. Then those single colony suspensions were inoculated on L?wenstein-Jensen slants at 37 ℃, from which the cultures of allM.tuberculosiscolonies were gathered and genomic DNA samples were extracted. The original clinical isolates and corresponding monoclonal strains were typed by means of Spoligotyping to compare the genotypes. Results showed that 32 clinicalM.tuberculosisisolates and 306 corresponding monoclonal strains were obtained. And the results of spoligotyping showed that 286 monoclonal strains had same spoligotypes as 30 original clinical isolates, but the monoclonal strains from two original clinical isolates showed diversity. The multiple infections rate ofM.tuberculosiswas 6.25%. It's suggested that spoligotyping can be used to distinguish multiple infections ofM.tuberculosisquickly and effectively.

Mycobacteriumtuberculosis; spacer oligotyping; multiple infections

Wan Kang-lin: Email: wankanglin@icdc.cn

國家科技重大專項課題(No.2013ZX10003002-001)資助

萬康林，Email:wankanglin@icdc.cn

1.溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院，溫州 325035； 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206； 3.四川大學華西基礎醫學與法醫學院病理生理教研室，成都 610041； 4.感染性疾病診治協同創新中心，杭州 310003

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.001

R378.91

A

1002-2694(2015)01-0001-05

2014-09-14；

2014-11-03

Funded by the Research Project of the National Key Program of Mega Infectious Disease (No. 2013ZX10003002-001)