華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的流行病學(xué)調(diào)查

谷松至，許黎黎，鮑琳琳，姚艷豐，秦　川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京　100021)

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華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的流行病學(xué)調(diào)查

谷松至，許黎黎，鮑琳琳，姚艷豐，秦川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)

【摘要】目的了解華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓亞型的分布和流行情況，為埃博拉病毒病的防控提供理論依據(jù)。 方法 采集華北地區(qū)動(dòng)物園及養(yǎng)殖場(chǎng)的多種哺乳動(dòng)物血清，對(duì)其進(jìn)行埃博拉病毒萊斯頓亞型的檢測(cè)。 結(jié)果 采集各種哺乳動(dòng)物血清共109份，經(jīng)Real-time PCR方法檢測(cè)未檢出陽(yáng)性樣品。 結(jié)論 埃博拉病毒尚未在華北地區(qū)流行，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)埃博拉病毒病的知識(shí)宣傳，并做好安全防護(hù)工作。

【關(guān)鍵詞】埃博拉；埃博拉病毒；萊斯頓亞型；流行病學(xué)

埃博拉病毒病(ebola virus disease)又稱埃博拉出血熱(ebola hemorrhagic fever)，是由埃博拉病毒(ebola virus)引起的一種急性的、高致死率的烈性傳染病，病死率可高達(dá)90%[1]。埃博拉病毒屬絲狀病毒科，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒[2]，被WHO列為“生物危害四級(jí)”病原。2013年3月，幾內(nèi)亞首次爆發(fā)了有記錄以來(lái)最嚴(yán)重的一次埃博拉疫情，并迅速蔓延至利比里亞、塞拉利昂等西非國(guó)家[3]。截至2015年1月4日，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表數(shù)據(jù)顯示埃博拉出血熱疫情肆虐的利比里亞、塞拉利昂和幾內(nèi)亞等西非國(guó)家的感染病例(包括疑似病例)已達(dá)20747人，其中死亡人數(shù)達(dá)到8235人[4]。

根據(jù)埃博拉病毒基因的位置、順序和數(shù)量的不同，可將埃博拉病毒分為5個(gè)基因型，即扎伊爾型(EBOV)、蘇丹型(SUDV)、本迪布焦型(BDBV)、塔伊森林型(TAFV)和萊斯頓型(RESTV)[5]。埃博拉病毒萊斯頓型雖不對(duì)人致病，但可對(duì)非人靈長(zhǎng)類有致死性，在美國(guó)和菲律賓有過(guò)猴子感染的報(bào)道[6]。而我國(guó)在2011年首次報(bào)道了從豬體內(nèi)也檢測(cè)到埃博拉病毒萊斯頓型[7]。目前我國(guó)雖尚未發(fā)現(xiàn)有感染埃博拉病毒病的患者，但不排除有埃博拉病毒隨著病毒攜帶者或引進(jìn)動(dòng)物(如猴子、黑猩猩等)而進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。為監(jiān)測(cè)華北地區(qū)埃博拉病毒萊斯頓型的分布和流行情況，進(jìn)一步確定是否有存在埃博拉病毒的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)采集華北地區(qū)動(dòng)物園及養(yǎng)殖場(chǎng)的哺乳動(dòng)物血清，對(duì)埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行核酸檢測(cè)，以期為埃博拉病毒的防控提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品采集

2014年9月，從華北地區(qū)的動(dòng)物園或養(yǎng)殖場(chǎng)采集猴、豬、雪貂、狗、貓等哺乳動(dòng)物的血清。置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2引物合成

埃博拉病毒萊斯頓亞型的引物序列為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，引物序列已申請(qǐng)專利保護(hù)(專利號(hào)：201510014997.0)。

1.1.3主要試劑和儀器

RNeasy Mini Kit提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，Superscript III First Strand Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，10×buffer、dNTP、Mg2+均購(gòu)自TaKaRa公司，熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix，96孔0.2 mL PCR反應(yīng)管Fast Optical 96-well RXN Plate，光學(xué)反應(yīng)蓋膜96-Well Optical Adhesive Film 25PK均購(gòu)自ABI公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用RNeasy Mini Kit提取試劑盒提取采集到的哺乳動(dòng)物血清的RNA，采用Superscript III First Strand Synthesis Kit試劑盒對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟參見(jiàn)說(shuō)明書。合成的cDNA置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2埃博拉病毒萊斯頓亞型的Real-time PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系為：模板2μL，dNTP 0.5μL，上、下游引物各1μL(10 pmol/μL)，10×buffer 1μL，Mg2+1μL，Ex Taq酶 0.1μL，DEPC水 8.4μL，Power SYBR Green熒光染料5μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后讀取熒光值。

將連有埃博拉病毒萊斯頓亞型的NP gene的全長(zhǎng)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。

2結(jié)果

2.1采樣情況

2014年9月，我們從華北地區(qū)的動(dòng)物園或養(yǎng)殖場(chǎng)共采集109份血清樣品。其中恒河猴51份，豬40份，食蟹猴4份，雪貂4份，狗3份，貓2份，金絲猴2份，大熊貓1份，黑猩猩1份，環(huán)尾狐猴1份。

2.2檢測(cè)情況

對(duì)采集到的109份哺乳動(dòng)物血清樣品，進(jìn)行埃博拉病毒萊斯頓亞型的Real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，109份血清樣本全部呈陰性。

3討論

埃博拉病毒病一直被認(rèn)為是動(dòng)物源性傳染病，而埃博拉病毒的自然宿主及其在自然界的循環(huán)和傳播方式尚不明確。有研究顯示，果蝠可能是埃博拉病毒的自然宿主之一。但從自然宿主直接到人類的感染很罕見(jiàn)，目前認(rèn)為是果蝠將埃博拉病毒直接傳染給非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人，感染病毒的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物再直接傳染給人[8]。感染者可通過(guò)多種途徑傳播埃博拉病毒，而接觸傳播是最主要的傳播途徑。通過(guò)接觸患者和被感染動(dòng)物的各種體液、分泌物、排泄物及其污染物感染即可感染埃博拉病毒[9]。在埃博拉疫情中，都有患者曾密切接觸過(guò)非人類靈長(zhǎng)類(大猩猩、黑猩猩等)和其他哺乳動(dòng)物(小羚羊、豬等)的尸體而被感染[10-14]。埃博拉病毒萊斯頓型不使人致病，但對(duì)非人類靈長(zhǎng)類有致死性，且使人隱性感染[15]。在美國(guó)和菲律賓就曾在接觸過(guò)獼猴和豬的人血清中檢測(cè)出萊斯頓型埃博拉病毒抗體，并且中國(guó)和菲律賓都有豬感染萊斯頓型的報(bào)道[5,16-18]。是否存在萊斯頓型在豬體內(nèi)變異，其使人感染的潛在危險(xiǎn)值得關(guān)注。

目前中國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)感染埃博拉病毒的病例，但隨著我國(guó)與世界各國(guó)之間的貿(mào)易、經(jīng)濟(jì)、旅游和人員往來(lái)的日益頻繁，埃博拉病毒通過(guò)各種途徑侵入我國(guó)不無(wú)可能。尤其是外來(lái)動(dòng)物(黑猩猩、猴子等)的引進(jìn)，更是提高了埃博拉病毒進(jìn)入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。并且我國(guó)的人群無(wú)免疫力，對(duì)埃博拉病毒普遍易感。而當(dāng)前尚無(wú)有效預(yù)防和治療埃博拉病毒病的疫苗和藥物[19]。因此，在加速研發(fā)疫苗和藥物的同時(shí)，密切的對(duì)埃博拉病毒的監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查顯得尤為重要。確診埃博拉病毒病的最主要方式是病原學(xué)檢測(cè)，而傳統(tǒng)的RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度不高、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性且不適用于大批量樣本的篩查。Real-time PCR檢測(cè)方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，在疾病暴發(fā)時(shí)可快速診斷，現(xiàn)已成為病原體檢測(cè)的重要方法。本調(diào)查對(duì)華北地區(qū)動(dòng)物園及養(yǎng)殖場(chǎng)的各種哺乳動(dòng)物進(jìn)行采樣，并對(duì)埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行檢測(cè)。集中采集易感染埃博拉病毒的哺乳動(dòng)物血清樣本109份，利用本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)埃博拉病毒萊斯頓型建立的Real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)埃博拉病毒萊斯頓型進(jìn)行核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，所采集的血清樣本全部檢測(cè)呈陰性，表明該地尚無(wú)埃博拉病毒萊斯頓型的流行。為埃博拉病毒萊斯頓型的防控提供理論依據(jù)。雖然并未在采集到的各類哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到埃博拉病毒萊斯頓型，但考慮到采樣量和采樣次數(shù)的局限，尚需進(jìn)一步研究。

總之，在對(duì)華北地區(qū)的哺乳動(dòng)物進(jìn)行埃博拉病毒病的監(jiān)測(cè)過(guò)程中并未檢測(cè)到埃博拉病毒萊斯頓型。但我們?nèi)孕枥^續(xù)開(kāi)展對(duì)埃博拉病毒萊斯頓型的流行病學(xué)研究，監(jiān)測(cè)埃博拉病毒萊斯頓型在人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物及其他哺乳動(dòng)物中的傳播流行規(guī)律，做到及時(shí)預(yù)警、及時(shí)控制、徹底杜絕埃博拉病毒病在人間的傳播。

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〔修回日期〕2015-03-30

調(diào)查報(bào)告

Epidemiology investigation for reston subtype of ebola

virus in north China area

GU Song-zhi，XU Li-li，BAO Lin-lin，YAO Yan-feng，QIN Chuan

(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Institute of Medical Laboratory

Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models,

State Administration of Traditional Chinese Medicine; Peking Union Medicine College, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo provide a theoretical basis for the prevention of Ebola virus disease, this survey aims to understand the distribution and prevalence status of Reston subtype of Ebola virus in north china area. Methods Collecting a variety of mammalian serums from zoos and farms in north china area, and detecting Ebola virus of Reston subtype. Results109 kinds of collected mammalian serums, there were no positive samples detected by the Real-time PCR method. Conclusion Ebola virus has not been found in north china area, we should strengthen the publicity of Ebola virus disease, and do well security work.

【Key words】Ebola；Ebola virus；Reston subtype；Epidemiology

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.017

【中圖分類號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0071-03

[通訊作者]秦川，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail： qinchuan@cnilas.org。

[作者簡(jiǎn)介]谷松至(1988-)，女，技師，E-mail： gusongzhi123@126.com。

[基金項(xiàng)目][基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金(31370203)；科技重大專項(xiàng)—艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2012ZX10004501-004)；北京市自然科學(xué)基金(7142106)。