結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞L選擇素的表達(dá)及意義

姜麗娜 姚春艷 金齊力 李柏青 (蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

結(jié)核病依然是全球重大衛(wèi)生問題，控制乃至消滅結(jié)核是一項(xiàng)全世界肩負(fù)的艱巨任務(wù)〔1〕。在抵御結(jié)核感染的過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)包括天然免疫和適應(yīng)性免疫都擔(dān)負(fù)著重要的職責(zé)。多形核細(xì)胞(PMN)或稱中性粒細(xì)胞是天然免疫細(xì)胞之一，在結(jié)核感染的早期發(fā)揮著重要的作用〔2〕。L-選擇素(CD62L)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞黏附分子選擇素家族的成員之一，可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的滾動〔3〕。本實(shí)驗(yàn)探討CD62L在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用，試圖為結(jié)核病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 新鮮外周血標(biāo)本來自結(jié)核病患者(均為蚌埠市傳染病醫(yī)院確診病例，簽署知情同意書)和正常人(均為我院健康教工和學(xué)生)。實(shí)驗(yàn)組:結(jié)核病患者32例，男19例，女13例，年齡22～67歲;對照組:正常人28例，男15例，女13例，年齡20～62歲。

1.2試劑 抗人CD62L-PE及同型對照鼠抗人IgG2a-PE購自eBioscience，RPMI1640培養(yǎng)液購自GIBCO公司，流式細(xì)胞儀，美國BD公司FACS Calibur。

1.3方法

1.3.1結(jié)核病患者PMN表面CD62L表達(dá) 取新鮮結(jié)核病患者抗凝全血放入流式管，30 μl/管，加入 CD62L-PE 3 μl避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，棄去上清，加氯化銨3 ml避光放置15 min溶解紅細(xì)胞，離心，棄上清，上流式細(xì)胞儀檢測和分析。每個樣本測定細(xì)胞數(shù)10 000個。

1.3.2結(jié)核分枝桿菌(M.tb)感染后PMN表面CD62L表達(dá)取新鮮結(jié)核病患者抗凝全血放入流式管，30 μl/管，加入制備好的 M.tb 懸液(濃度 5×108/ml)30 μl/管，混勻，37℃孵育30 min，再加入CD62L-PE，用流式細(xì)胞儀檢測PMN表面CD62L表達(dá)率，同時正常人作對照，并計(jì)算M.tb感染前后CD62L表達(dá)變化率。M.tb感染后CD62L表達(dá)降低率=(感染前CD62L表達(dá)率－感染后CD62L表達(dá)率)/感染前CD62L表達(dá)率×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

結(jié)核病患者和正常人PMN在M.tb感染前CD62L的表達(dá)率〔(87.12±14.73)%、(82.64±18.06)%〕均明顯高于 M.tb 感染后 CD62L 表達(dá)率〔(9.22±5.95)%、(12.35±10.66)%〕(P＜0.05)，而結(jié)核病患者與正常人在M.tb感染前、后PMN表面CD62L表達(dá)率及降低率〔(89.26±6.61)%、(86.22±10.50)%〕無明顯差異(P＞0.05)。

3討論

機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌時，PMN最先聚集到炎癥區(qū)域，發(fā)揮吞噬和殺傷功能，構(gòu)成了宿主抵抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵性機(jī)制，PMN的趨化作用是此過程的第一重要環(huán)節(jié)〔4～6〕。CD62L主要集中表達(dá)在PMN的微絨毛突起上，使得PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而有利于中性粒細(xì)胞的滾動、黏附。在細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等刺激因素的作用下，PMN激活后，構(gòu)象發(fā)生改變，CD62L迅速從PMN表面脫落，使PMN與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用降低，從而為PMN的游出提供了良好的前提條件〔7〕。有研究證明，CD62L缺陷型小鼠白細(xì)胞對炎癥反應(yīng)比野生型小鼠弱，且白細(xì)胞在血管外的移行距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型小鼠的移行距離〔8〕。Mulligan等〔9〕研究證明，應(yīng)用 CD62L單克隆抗體能夠阻斷白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附，而且能夠阻止白細(xì)胞的滲出。這些資料都說明CD62L在介導(dǎo)白細(xì)胞的游出和與移行過程中發(fā)揮重要的作用。通常將PMN表面CD62L的表達(dá)下調(diào)看作是PMN活化的標(biāo)志。那么，當(dāng)機(jī)體遇到結(jié)核分枝桿菌刺激時，PMN被激活，從血管中游出到達(dá)感染區(qū)域而引起結(jié)核炎癥反應(yīng)，此過程中CD62L是否也發(fā)揮作用呢?

已有研究表明，PMN在小鼠氣道感染結(jié)核分枝桿菌后，最先到達(dá)感染部位，在急性感染早期發(fā)揮重要的防御作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)核病患者既往感染過結(jié)核分枝桿菌，目前體內(nèi)PMN處于未激活狀態(tài)，因此PMN CD62L表達(dá)與正常人PMN CD62L表達(dá)基本無明顯差別。PMN被結(jié)核分枝桿菌激活后，CD62L迅速從PMN表面脫落，表達(dá)下調(diào)。這一結(jié)果說明，結(jié)核分枝桿菌作為刺激因素導(dǎo)致PMN激活后，CD62L脫落，才使得PMN能夠移行和游出。設(shè)想機(jī)體感染了結(jié)核分枝桿菌，在體內(nèi)PMN就會被結(jié)核分枝桿菌刺激而發(fā)生活化，CD62L從PMN表面迅速脫落導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)，這就有利于起始黏附的PMN與內(nèi)皮細(xì)胞脫離，進(jìn)而穿越和移行到達(dá)炎癥反應(yīng)區(qū)域，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)和脫顆粒等效應(yīng)殺傷結(jié)核分枝桿菌引起炎癥反應(yīng)。結(jié)核炎癥的發(fā)生正是機(jī)體抗結(jié)核感染免疫功能的重要體現(xiàn)，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以消滅結(jié)核分枝桿菌，而過度的炎癥反應(yīng)則會引起細(xì)胞和組織的損傷。同時也發(fā)現(xiàn)在正常人體外PMN感染結(jié)核分枝桿菌時，PMN表面CD62L的表達(dá)也顯著降低，說明正常人的PMN被結(jié)核分枝桿菌感染后也發(fā)生活化，CD62L脫落后導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)。而正常人與結(jié)核病患者PMN CD62L在結(jié)核分枝桿菌刺激后表達(dá)降低的比率無明顯差異。說明結(jié)核病患者PMN和正常人PMN同樣在結(jié)核感染早期都會發(fā)揮抗結(jié)核感染免疫保護(hù)作用。

1 World Health Organization.Global tuberculosis report 2013〔R〕.World Health Organization Geneva，2013.

2 Antony VB，Sahn SA，Harada RN，et al.Lung repair and granuloma formation:tubercle bacilli stimulated neutrophils release chemotactic factors for monocytes〔J〕.Chest，1983;83(5 Suppl):95S-96S.

3 Simon SI，Cherapanov V，Nadra I，et al.Signaling functions of L-selectin in neutrophils:alterations in the cytoskeleton and colocalization with CD18〔J〕.J Immunol，1999;163(5):2891-901.

4 Appelberg R，Castro AG，Gomes S，et al.Susceptibility of beige mice to Mycobacteriumavium:role of neutrophils〔J〕.Infect Immun，1995;63(9):3381-7.

5 Riedel DD，Kaufmann SHE.Chemokine secretion by human polymorphonuclear granulocytes after stimulation with Mycobacterium tuberculosis and lipoarabionmannan〔J〕.Infect Immun，1997;65(11):4620-3.

6 Jaillon S，Galdiero MR，Del Prete D，et al.Neutrophils in innate and adaptive immunity〔J〕.Se min Immunopathol，2013;35(4):377-94.

7 Rogowski O，Sasson Y，Kassirer M，et al.Down-regulation of the CD62L antigen as a possible mechanism for neutrophilia during inflammation〔J〕.Br J Haematol，1998;101(4):666-9.

8 Hickey MJ，F(xiàn)orster M，Mitchell D，et al.L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo〔J〕.J Immunol，2000;165(12):7164-70.

9 Mulligan MS，Miyasaka M，Tamatani T，et al.Requirements for L-selectin in neutrophil-mediated lung injury in rats〔J〕.J Immunol，1994;152(3):832-40.

10 Seiler P，Aichele P，Bandermann S，et al.Early granuloma formation after aerosol mycobacterium tuberculosis infection is regulated by neutrophils via CXCR3-signaling chemokines〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(10):2676-86.