神經前體細胞、神經元細胞、神經膠質細胞的生物標志物

神經前體細胞、神經元細胞、神經膠質細胞的生物標志物

李姣潘治斌1徐仁伵

(南昌大學第一附屬醫院神經內科，江西南昌330006)

關鍵詞〔〕生物標志物;神經前體細胞;神經元細胞;神經膠質細胞

中圖分類號〔〕R741〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30560042，81160161)

通訊作者：徐仁伵 (1969-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事肌萎縮側索硬化和帕金森病的發病機制和防治研究。

1九江市第一人民醫院

第一作者：李姣 (1990-)，女，碩士，主要從事肌萎縮側索硬化的防治研究。

美國癌癥研究中心將生物標記物定義為通過對細胞內的某一生物化學成分、結構或功能的檢測來客觀獲取機體正常或疾病狀態下的生理病理過程和疾病發生發展、治療、預后等信息的物質。在中樞神經系統中，本文通過免疫組化、免疫熒光等研究方法用各種生物標志物特定標記神經細胞來區分不同類型神經細胞，并且研究不同種類神經細胞在不同發育階段在中樞神經系統的分布、增殖、分化、遷移及作用。本文將對神經前體細胞、神經元細胞、神經膠質細胞的生物標志物的研究進展作一綜述。

1神經前體細胞

1.1巢蛋白(Nestin)Nestin其cDNA全序列5 983 bp,編碼一個含有1 821個氨基酸的蛋白質，它的形態類似于波形蛋白、索蛋白、神經絲等其他中間絲類蛋白，但在結構上的一些特殊性決定了它功能的特殊性。它的N末端很短，不能形成同型二聚體組成中間絲，只能與波形蛋白或肌間線蛋白共同形成異二聚體組裝為中間絲，因此，被定義為第六類中間絲蛋白，主要表達于未分化、具有分裂能力的細胞中，主要分布在細胞質內并參與細胞骨架的構成。在中樞神經系統發育過程中，Nestin在胚胎早期的神經上皮表達，出生后即停止表達；神經前體細胞最先表達Nestin，隨后表達波形蛋白(Vimentin)；當神經細胞的遷移基本完成后，Nestin的表達逐漸減少，一旦神經前體細胞朝向終末方向分化成神經元和膠質細胞時，Nestin便停止表達，取而代之的成熟神經元細胞和星形膠質細胞分別表達其特異性標志物神經絲蛋白(NFP)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)；故在哺乳動物中樞神經系統內，Nestin被認為是中樞神經系統發育過程中神經前體細胞的標志之一〔1〕。Dahlstrand等〔2〕研究認為Nestin特異性表達于中樞神經系統的神經前體細胞中，但也存在一些特例：(1)一些中樞神經前體細胞不表達Nestin：如海馬前體顆粒神經元、嗅覺上皮細胞；(2)一些有絲分裂后的中樞神經細胞也表達Nestin：如小腦白質和端腦E15.5中間區域；(3)一些非中樞神經系統的細胞表達巢蛋白：如未成熟的心肌和骨骼肌細胞、血管內皮細胞等細胞。最新研究〔3〕發現，Nestin不僅存在于所有哺乳動物胚胎發育期的中樞神經系統，而且在成體中樞神經系統廣泛分布，如嗅球、小腦、邊緣葉、間腦、腦干、腦室系統周圍、脊髓中央管附近、脊髓后角、大腦皮質等都具有大量的Nestin分布。現在大多數研究已證實，Nestin在中樞神經系統和周圍神經系統大多數增殖活躍的前體細胞中表達，發育成熟的神經系統Nestin表達降低，而損傷的神經系統Nestin表達又重新升高。Krupkova等〔4〕發現成年動物中樞神經系統損傷后導致星形膠質細胞重新激活過程中，可觀察到細胞重新表達Nestin蛋白，且Nestin蛋白的表達會維持很長時間，表明Nestin蛋白與神經元和膠質細胞的分化有密切關系。Nestin的明顯上調是成年動物中樞神經系統內星形細胞激活的標志，其重新表達可能代表著星形細胞重現其活性狀態，它們可能參與了成年動物神經重塑和修復過程。在機械性腦損傷、腦缺血及興奮性毒性腦損傷等應激刺激下，神經細胞可出現胚胎期的逆轉，特異性及一過性地異常表達Nestin蛋白。

1.2VimentinVimentin，波形蛋白是目前已知表達最廣泛的Ⅲ型中間絲蛋白，主要存在于間充質來源的細胞中，由464個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為57 kD，在結構上可分為三個部分：氨基末端的頭部(103個氨基酸)、羧基末端的尾部(55個氨基酸)和兩端之間的中間的桿狀主域構成。在哺乳類的神經系統發育期，它暫時表達在神經元和膠質細胞系的前體細胞，隨著發育的進行，神經前體細胞進行有絲分裂，完成增殖和分化，形成較為成熟的神經元和膠質細胞，沿放射狀纖維進入腦實質或遷移入特殊組織層，Vimentin逐漸被其他中間絲蛋白如NFP、GFAP等所取代。除了腦膜和血管，Vimentin主要位于未成熟膠質細胞、室周膠質細胞、無髓白質內的膠質細胞、大腦皮質和基底節的放射狀膠質細胞、小腦的博格曼膠質細胞、少量的成年神經元和脊髓室管膜細胞和中樞神經系統向周圍神經系統的移行區。有學者在研究人胚胎(9、13、28 w)大腦后發現Vimentin陽性細胞形態多樣，大小不一，多呈圓形，分布廣泛，特別是嗅球、海馬、紋狀體以及腦室下區均可見到Vimentin陽性的細胞，并且隨發育時期及部位不同，細胞形態及突起情況各異，說明了Vimentin參與胚胎時期腦的發育。采用共聚焦免疫熒光組織化學染色觀察到，大量不同染色強度的Vimentin陽性細胞廣泛分布于新生大鼠的大腦皮質、海馬結構、腦室及脊髓等部位，主要表達于細胞的胞質及突起內，Vimentin的表達隨著年齡的增加逐漸減弱，在細胞質和細胞核中均有表達。有學者發現構成血腦屏障的毛細血管周細胞存在Vimentin的高表達,還可定位于中樞神經系統的未分化細胞的神經絲狀足樣芽生〔5〕。

1.340 kD微管結合蛋白質(DCX)一個表達在中樞神經系統有絲分裂后的神經細胞中，僅出現于神經元形成的前3 w，是移行的神經元前體細胞的標志物。DCX主要分布在4個神經發生相關區域：室下區、海馬齒狀回的粒下層、吻側遷移流和嗅球當中。DCX免疫陽性細胞在形態上呈梭形的胞體和單個的前導突起，大小基本一致。在所有分布區域中室下區的DCX免疫陽性細胞密度最高，其次為嗅球。嗅球中的DCX免疫陽性細胞以嗅球中心為核心呈放射狀排列，越靠近嗅球周邊DCX免疫陽性細胞的前導突起朝向越紊亂。在皮質偶爾可以見到DCX免疫陽性細胞，但其數量極其稀少。在吻側遷移流中DCX免疫陽性細胞呈規則的有序排列，其前導突起朝向基本相同，均朝向嗅球；在齒狀回粒下層的DCX免疫陽性細胞，前導突起大部分朝向并伸入分子層。有研究通過分析50個成年小鼠大腦中DCX的表達，發現DCX是在新生成的神經細胞中特異性表達，而且主要分布在齒狀回和腦室下區中，DCX和GFAP表達的新生成的細胞內沒有共定位，說明DCX不表達神經前體細胞分化的星形膠質細胞。研究發現DCX在生后早期大腦和成人腦室下區和海馬表達呈低水平，這些細胞可以形成神經球，并且可以標記神經元細胞標志物β-微管蛋白或微管相關蛋白2(MAP2)。Yoo等〔6〕發現在小鼠軀體感覺皮層和海馬CAl區，出生后第1天DCX表達最為強烈，隨時間延長，DCX表達逐漸降低，在成熟神經元中無表達。綜合上述研究可以得出結論：DCX可特異性標記神經元前體細胞，陽性細胞可分化為神經元細胞，而不分化為星形膠質細胞。DCX有利于神經前體細胞在細胞培養中的遷移和跨越神經組織，在其有絲分裂之間保持正確的平衡中發揮重要作用〔7〕,在神經元前體細胞的核易位、軸突和樹突成熟等微管相關細胞活動中也起著非常重要的作用，但DCX可抑制神經前體細胞的增殖，減少會導致前體細胞在皮質發育的衰竭。

1.4硫酸軟骨素蛋白聚糖2(NG2)NG2是一種由2327個氨基酸構成的一種300 kD高分子量的I型跨膜蛋白，被廣泛認為是少突膠質前體細胞特異性標志物。最開始時在培養的早期腦內膠質細胞中發現有一種叫少突膠質-Ⅱ型星形膠質細胞(O2A細胞)的細胞能被NG2抗體標記，這類細胞在形態上類似于星形膠質細胞，但不表達星形膠質細胞標志物GFAP，而表達NG2，將該細胞命名為NG2膠質細胞，也被稱少突膠質細胞前體細胞(OPC)，OPC可增殖及分化成為少突膠質細胞及Ⅱ型星狀膠質細胞，甚至可能分化為神經元細胞。NG2陽性細胞不僅在發育小鼠胚胎中樞神經系統廣泛分布，還分布于成年大鼠中樞神經系統的大腦皮質、嗅球、杏仁核、紋狀體、丘腦、海馬齒狀回、腦干的中腦、延髓、小腦和脊髓中。成年的NG2陽性細胞在中樞神經系統中占所有膠質細胞的5%~8%，且在灰質和白質比例略有區別，白質區占8%~9%，灰質區占2%~3%，其在皮質和海馬區域與少突膠質細胞的比例為1∶1。NG2陽性細胞在不同的部位形態也不同，例如在灰質區，胞體呈圓形或橢圓形，細胞有較多的突起且呈放射狀從胞體發出；而在白質區，胞體呈長條狀或梭形，其突起也呈兩級發散狀態，并與軸突平行。不同的時期NG2細胞形態也有差異，在胚胎期的NG2細胞呈典型的單極或雙極狀前體細胞的形態，隨著發育NG2細胞逐漸轉變成星狀。NG2陽性細胞具有很強的分裂增生能力及較強的自我更新能力，能分化為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元細胞，這個祖細胞群目前被認為是早期多能祖細胞或干細胞〔8〕，即神經前體細胞。

1.5唾液酸神經細胞黏附因子(PSA-NCAM)PSA-NCAM主要在胚胎發育過程中的神經前體細胞和未成熟神經細胞表達。NCAM(神經細胞黏附因子)是細胞表面的糖蛋白，屬于細胞免疫超蛋白家族，細胞黏附因子的一種。成熟動物的NCAM主要在神經系統中表達，神經管閉合后直至成熟過程中均有表達。NCAM的Ig結構域上有多個PSA結合位點，PSA-NCAM是PSA通過唾液酸轉移酶在高爾基體內與NCAM結合而成，主要在胚胎發育過程中表達，但在成年后一些具有神經可塑性的腦區如腦室下區、海馬齒狀回區、顳葉皮質、丘腦-垂體神經部、嗅球、梨狀葉及內側皮質、杏仁核也可表達。Kim等〔9〕研究使用細胞分揀技術發現大量的神經前體細胞表達PSA-NCAM以及Nestin和Musashi1，其中PSA-NCAM陽性的神經前體細胞可分化成TUJ1和/或NeuN陽性的神經元細胞、O4陽性的少突膠質前體細胞和GFAP陽性的星形膠質細胞，表明PSA-NCAM陽性的神經前體細胞(NPCS)是多能神經干細胞，是能夠生成各種神經細胞亞型的原始神經前體細胞。PSA-NCAM不僅可以作為一個標記，還可以用于純化中樞神經系統的神經前體細胞，并且能從多能干細胞的早期神經衍生物鑒別神經嵴細胞。Bonfanti等〔10〕研究發現PSA-NCAM與神經膠質前體細胞高度相關，在體內，圍產期腦室下區(SVZ)中包含的PSA-NCAM陽性的祖細胞群可遷移到胼胝體和皮質處產生星形膠質細胞和少突膠質細胞。在大鼠皮層神經元的培養中研究中發現PSA-NCAM的丟失或失活會導致神經細胞分化和存活減少，而在發育中神經細胞的遷移、軸突生長和突觸發生期間PSA-NCAM表達高，說明PSA-NCAM的合成及其在細胞表面的表達被體內和體外的神經活動和跨膜的信號所控制，在執行神經細胞的可塑性和跨膜信號中起重要作用。

1.6Musashi1Musashi家族是一類進化保守的RNA結合蛋白家族，是一種強烈表達于胎兒和成體神經前體細胞神經RNA結合蛋白，包括Musashi-1和Musashi-2成員。第1個Musashi家族成員即Musashi-1，由362個氨基酸組成，基因定位于染色體12q24.1-31，蛋白分子量為39 kD，首先在果蠅中得到鑒定，被認為是果蠅不對稱分裂感覺前體細胞的蛋白質。小鼠中，Musashi1主要表達在產后的腦室周的神經干細胞和未分化的神經前體細胞中，密切參與不對稱分裂產生的分化細胞以及中樞神經系統神經前體細胞的胚胎發育過程。有研究發現在成年大鼠側腦室周圍的腦室區內可見Musashi1免疫反應陽性，胞體小圓形，無突起或1~2個短突起，分布疏密不均勻；隨年齡增長，側腦室周圍的腦室區內Musashi1陽性細胞逐漸減少，老年組大鼠仍然有一定數量的Musashi陽性細胞，得出結論為大鼠側腦室區內存在有Musashi1陽性細胞，并隨年齡增長而明顯減少，這些細胞可能是Musashi陽性的神經前體細胞，其遷移能力和范圍有增齡性的降低。Musashi1蛋白表達定位于前體細胞的細胞質和細胞核中，陽性細胞具有分化成神經元、膠質細胞和腸上皮細胞的能力，并且隨著細胞分化的進行表達下調，到成年時含量非常低，只在幾個器官中持續表達，如腦、睪丸和腸〔11〕。

1.7SSEA-1階段性特異性胚胎抗原(LEX抗原)，也稱為三糖3-巖藻糖基-N-乙酰基乳糖胺或FAL或CD15，是一種被分子量為80 kD的溶酶體相關膜蛋白1(LAMP-1)載體分子運載的蛋白的細胞表面的糖復合物，不僅在小鼠和人的胚胎干細胞、畸胎瘤細胞和原始生殖細胞中表達，而且在中樞神經系統細胞的發育和成年階段表達。在中樞神經系統中，主要在SVZ特異識別神經前體細胞，在小鼠胚胎端腦和小腦外顆粒層、成年小鼠的中樞神經系統的生發區的神經前體細胞中均有陽性表達，某些星形膠質細胞也可表達。Yagi等〔12〕通過熒光免疫方法發現SSEA-1可作為小鼠的神經前體細胞的標記分子，不僅在細胞表面上而且在細胞內表達，其表達與鞘糖脂硫酸軟骨素蛋白聚糖、糖蛋白、β1整合素、Wnt-1有關。D'Costa等〔13〕有以火雞為研究對象的研究中發現SSEA-1可在多能和增殖的神經上皮細胞和遷徙神經嵴細胞表達，并被限制在脊神經管，說明該抗原還可能與神經系統的感官形成有關，并且參與脊椎神經系統的發育，調節中樞神經系統的干細胞群，是維持干細胞環境的重要參與者。另有研究認為SSEA-1和GFAP表達陽性的細胞是反應性星形膠質細胞，但其真實性有待進一步研究。

1.8CD133單克隆抗體，也稱為prominin-1，是一種分子量為115 kD或100 kD的膽固醇結合跨膜糖蛋白，存在于各種哺乳動物和非哺乳脊椎動物的中樞神經系統神經前體細胞中，被認為是胚胎神經干細胞的標志。CD133在小鼠出生后早期階段分布在中間放射狀膠質細胞或者室管膜細胞，成年腦中分布在室管膜細胞，但側腦室神經膠質細胞區不表達。除了神經上皮細胞，視網膜神經節細胞也可表達CD133〔14〕。研究發現CD133與Nestin在神經前體細胞分化時表現出較高的共表達，而在誘導神經元分化過程中，CD133與星形膠質細胞(GFAP)、神經元細胞(β-微管蛋白)、少突膠質細胞(Olig)不存在共表達。CD133不表達分化后的細胞，只表達Nestin陽性的細胞，故推斷CD133和Nestin一樣，在神經前體細胞中特異性表達。CD133的表達維持在胚胎干細胞分化成神經、上皮及中胚層細胞階段及分化的終末階段；其表達并不局限于神經祖細胞，還表達于成人上皮細胞，如腎近端小管、非上皮細胞，特別是視桿細胞。

1.9多唾液酸神經節苷脂(A2B5)最開始研究發現A2B5主要在鼠、雞、兔的小腦，雞視網膜、小鼠脊髓和背根神經節的一小部分星形膠質細胞中表達，且不成熟的星形膠質細胞A2B5的表達比成熟的星形膠質細胞的表達多。Dietrich等〔15〕研究通過從冷凍保存18~20 w舊胎腦的神經祖細胞分離出的神經膠質前體細胞，發現它們可以在有堿性成纖維細胞生長因子的純化無血清培養基中生長，并表達A2B5，分化后的細胞表達O4、O1和GC標記的少突膠質細胞系，而不表達NeuN、Tau標記的神經元細胞譜系。我國學者唐軍等〔16〕發現A2B5抗體標記神經膠質前體細胞，并可分化為成熟的O1、O4標記的少突膠質細胞，而不分化為GFAP標記的星形膠質細胞。綜合所述，認為A2B5可特異性標記神經膠質前體細胞，陽性細胞可分化為神經膠質細胞，不分化為神經元細胞。另外，還有研究發現A2B5還可在少數不成熟神經元細胞膜上表達，其可靠性有待我們進一步考證。

1.10半乳糖腦苷脂(GC)是由50 kD和30 kD蛋白質組成的80 kD的混合物，是少突膠質前體特有的的脂類。Ghandour等〔17〕用免疫熒光技術發現半乳糖腦苷脂特定表達于少突膠質祖細胞，其免疫反應在整個少突膠質前體細胞的細胞膜，可用于觀察少突膠質前體細胞的形態學變化過程，是最早少突膠質祖細胞標志物表達之一。胡大勇等〔18〕在“大鼠脊髓損傷后”的研究中用免疫組化方法時發現少突膠質細胞培養的第一天呈現GC陽性，且細胞形態典型，而無GFAP陽性顯色，進一步說明GC識別的是少突膠質細胞譜系，非星形膠質細胞。

2神經元細胞

2.1神經元核抗原(NeuN)也被稱為單克隆抗體A60，是廣泛標記識別有絲分裂后的神經元的一種可溶性核蛋白，其免疫反應在神經元分化成熟后開始出現，在免疫印跡檢測中顯示兩條帶，其分子量為46~48 kD，在體外具有與DNA結合的活性，體內有與RNA結合的活性。最開始研究發現NeuN可在包括嚙齒類、鳥類等脊柱動物和蠑螈等神經系統幾乎所有的成熟神經細胞核發生免疫反應，包括位于脊髓、大腦皮質、海馬、背側丘腦、尾殼核、小腦等處的神經元。王新紅等〔19〕在研究“大鼠的NeuN的特異性表達”發現NeuN表達于大腦皮質、基底核、脊髓背角等大部分神經元，在三叉神經脊束核、下丘腦室旁核等部分神經元為中等表達，并弱表達于孤束核、藍斑等部分神經元；視上核、弓狀核、迷走神經背核等有些核團神經元則缺乏NeuN表達。另外，有一些神經元細胞不能被NeuN特異性標記，如小腦皮質的浦肯野細胞、嗅球的帽狀細胞、交感神經節的神經元以及視網膜感光細胞和絕大多數內核層細胞，這些細胞在形態、信息合成、新陳代謝等方面有一些獨立的表現。NeuN在神經元細胞分化初期出現，成年中維持，在體外原代培養的神經元細胞也可以被NeuN抗體識別。因此現在普遍認為NeuN抗體可以作為胚胎和成年動物的中樞和周圍神經系統中神經元的識別標志。然而Portiansky等〔20〕研究發現NeuN在老年動物的頸椎、胸椎和腰椎的免疫反應完全喪失，提示NeuN可能不是一個可靠的標志來識別衰老大鼠的脊髓神經元。

2.2神經元特異性烯醇化酶(NSE)一個二聚體糖酵解酶，含有兩個γ亞基，分子總量為78 kD，起源主要來自神經元和神經內分泌細胞，是一種在血小板合成的α-γ混合細胞質烯醇化酶形式，是神經元細胞的特異性標志物。Marangos等〔21〕發現神經元和大腦成熟的神經膠質細胞可以通過糖酵解酶烯醇化酶的同工酶內容區分開來，神經元含有NSE，神經膠質細胞具有非神經元烯醇化酶(NNE)，其中NSE由高到低依次位于腦、脊髓、周圍神經節中。在大鼠腦發育過程中用特定的放射免疫測定法測定發現NSE在胚胎大腦水平非常低，隨著神經元細胞的形態和功能的成熟含量逐漸增加，并逐漸上升至成人水平，說明NSE標記的為成熟神經元細胞。NSE正常條件下特異性地存在于神經元細胞質內，但當缺氧、缺血或中毒的情況下，神經元細胞膜完整性受到破壞，NSE被釋放入腦脊液或通過血腦屏障進入血管內，從而進入外周循環，故血清NSE水平可反映腦梗死后神經細胞的損害程度，是神經元損傷的特異性指標，也是腦組織破壞后較合適的外周生化標記。

2.3β-微管蛋白(β-Ⅲtubulin)編碼的基因位于人類16號染色體的長臂，其蛋白C-末端有可變結構域的15個氨基酸，形成7個同型β-微管蛋白，分布于不同的組織，而其中β-Ⅲ tubulin(也稱為TUJ-1)主要存在于神經元細胞中。有研究用免疫組化技術發現β-Ⅲ tubulin抗體主要在對甲醛固定石蠟包埋的外周和中樞神經系統神經元細胞特異性染色，主要在神經元胞體、樹突、軸突和軸突終端染色，而在星形膠質細胞、少突膠質細胞、脈絡叢細胞不染色，故得出結論β-Ⅲ tubulin在可作為神經元細胞的特異性標志物。β-Ⅲ tubulin在脊椎動物人類、老鼠、雞和魚中除了小腦浦肯野神經元外的所有神經元細胞的有絲分裂的始末均表達，這說明β-Ⅲ tubulin可能是神經細胞的調控譜系和早期形態分化必要的轉錄因子。杜喆等〔22〕研究發現在神經元細胞的培養過程中分化的第1天，β-Ⅲ tubulin表達弱，主要分布于核周，第4天時細胞表達增多并伸出突起，分化第7天時β-Ⅲ tubulin減低，并在突起末端可見陽性表達。在分化初期，β-Ⅲ tubulin陽性反應明顯分布于核周，較密集排列；隨神經元分化逐漸成熟，β-Ⅲ tubulin的表達呈現先逐漸增加后降低，陽性標記散在分布于胞質中，組成網狀，可以伸入到突起內，認為β-Ⅲ tubulin是神經元細胞的特異性微管蛋白，是神經元細胞早期發育的標志。β-Ⅲ tubulin還可促進微管的形成，進而影響神經元的分化及突起生長。

2.4微管結合蛋白2(MAP2)為結構性微管相關蛋白家族的一員，一種熱穩定的磷蛋白。MAP2由單個基因編碼，通過選擇性剪切形成多種轉錄子和亞型，包括高分子質量的MAP2a(280 kU)和MAP2b(270 kU)及低分子質量的MAP2c(70 kU)和MAP2(75 kU)。MAP2是大腦中樞神經系統含量豐富的主要表達蛋白之一，主要存在于神經元細胞胞體、樹突、樹突棘和突觸后密度中〔23〕。有研究用免疫組化法也證實了MAP2特異性表達于神經元細胞，在神經元胞質和突起呈免疫反應陽性，培養神經元細胞的第3天MAP2免疫反應陽性細胞率為(87.5±3.5)%，培養第6天MAP2免疫反應陽性細胞率為(90.2±5.1)%。MAP2標記的神經元可顯示各種形態表型，胎兒期位于不成熟雙極神經元和倒金字塔狀細胞中；在早期早產期間位于更成熟的多極神經元或梭形的神經元；在圍產期MAP2陽性的神經元達到最高形態的復雜性，顯示出龐大、多極、曲長的樹突和許多分支。MAP2特異性的表達也可反映出體內損傷的變化。萬虹等〔24〕研究發現正常大鼠腦組織MAP2免疫反應發生在神經元的樹突和胞體，電針損傷后可見MAP2在不同的神經元如固縮神經元、輕度受損神經元、正常神經元產生免疫反應，認為MAP2在中樞神經系統損傷中的免疫反應是觀察神經元功能狀態的敏感指標之一。MAP2通過細胞骨架連接一些信號蛋白或膜受體的突觸后膜，促進微管形成、保持微管穩定、誘導微管成束，還可能參與神經元發育、突起形成和生長、軸突和樹突的細胞器運輸、穩定結構、傳導信號。

2.5神經絲蛋白(NFP)屬于中間絲蛋白家族的第Ⅳ類型，已被廣泛地作為中樞和外周神經系統的神經元細胞標記物，按照相對分子質量的不同可分為NF-68(NF-L)，NF-160(NF-M)和NF-20(NF-H)。最早認為發現NF-L和NF-M基因表達于胎兒期，高含量NF-H基因的表達被推遲到產后期，NF-L抗體在神經元突起染色是最突出的，在有髓軸突的放射狀生長中起著極為重要的作用〔25〕。NEP主要對大腦皮層、小腦皮層、海馬和紋狀體結構以及腦干內的一些錐體細胞、藍狀細胞、下橄欖核內的神經元及髓質內部分纖維神經元特異性的標記。在光鏡下觀察到NFP陽性部位在軸突細胞質，其中在大腦額頂葉皮層內主要出現在外錐體層、內錐體層和多形層。王省等〔26〕在研究“脊髓中NFP陽性細胞分布”發現在小鼠胎齡16 w時，NFP陽性神經元胞體呈圓形、卵圓形，突起少，胞核大，有偏極現象，至32 w時胞體呈錐形、梭形、多角形；胞體逐漸增大，胞質逐漸增多，胞核多位居中央；脊髓側角內NFP陽性神經元可由中央管向外遷移，而脊髓前角神經元由外向內遷移；密度在胚胎早期逐漸升高，晚期呈下降趨勢。由此證明了不僅成熟的神經元細胞可表達NFP,而且未發育成熟的神經元內也可陽性表達NFP，陽性神經元密度隨胎齡增加而逐漸增加，形態逐漸成熟〔26〕。

2.6TauTau蛋白，單克隆抗體，特異性標記神經元細胞軸突。Tau蛋白是55~74 kD的低分子量的微管相關蛋白，人Tau蛋白編碼的基因位于17號染色體，因16個外顯子在C-端進行選擇性剪接以致得到Tau不同長度的亞型，故在正常成年人腦中存在6種Tau蛋白變異體。Tau蛋白的主要任務是穩定和支撐微管〔27〕，被認為是對神經元細胞的形態發生，特別是軸索伸長和維持所必需的。Tau蛋白陽性表達主要分布于海馬、腦室周、嗅球、額葉及顳葉的神經元細胞中，隨著年齡的增長低分子量Tau蛋白表達逐漸減少，中分子量Tau蛋白逐漸增加，其中低分子量Tau蛋白主要分布在腦神經元的軸突中，而高分子量Tau蛋白主要分布于外周神經系統中。有研究分別用免疫組化方法分別在小鼠的小腦、延髓和黑質中加抗Tau、抗β-Tubulin、抗MAP2單克隆抗體染色，比較各自染色效果，發現在髓質中，β-Tubulin染色主要在細胞體、樹突、軸突，而MAP2主要在樹突和細胞體，很少軸索染色，相比之下，Tau蛋白的定位主要局限于軸突，沒有任何胞體或樹突染色，進一步說明Tau蛋白特異性標記神經元軸突。在研究成年大鼠大腦、小腦、腦干、腦脊髓時利用免疫化學染色的方法發現tau蛋白抗體標記標本發現所有區域的軸突染色陽性，其中在內囊、胼胝體和小腦的白質更為明顯。用β-Tubulin蛋白和Tau蛋白抗體雙標發現標本均染色，Tau蛋白抗體主要在神經元細胞軸突染色，在少突膠質細胞也染色，星形膠質細胞不被染色；分析認為tau蛋白細胞體內合成被運送到軸突之前必須通過微管運送，而少突膠質細胞中存在有豐富的微管，故少突膠質細胞也可染色，故認為Tau不僅在神經元的軸突上存在，還可能在中樞神經系統廣泛分布。Tau抗體除了特異性在中樞神經系統中表達，還廣泛表達于非神經系統的許多組織，如心臟、骨骼肌、肺、腎和睪丸中存在相對高水平，在腎上腺、胃、肝為相對低水平〔28〕。

2.7泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)也稱為PGP9.5，特異性表達于神經元細胞。于1987年由Day等發現，是一個由9個外顯子編碼、共223個氨基酸組成的一種分子質量為27 KDa的蛋白質，基因位于4號染色體短臂的1區4帶，是UCH家族的四種蛋白之一。UCH-L1在各個腦區的神經元都有表達，黑質中尤其豐富，大約占總可溶蛋白的1%~2%，在背根神經節和三叉神經節等周圍神經系統中也存在〔29〕。Vukojevic等〔30〕在研究海馬神經元中證明UCH-L1被分布海馬神經元胞體和樹突，其定位于神經元的樹突棘，表達的細胞可能是終末分化的神經元。因UCH-L1具有泛素水解酶、泛素連接酶活性以及不依賴于其自身酶活性的穩定泛素單體的功能，所以被認為是維持正常突觸結構和功能必需的，另外還認為是測定神經元細胞損傷的重要標記。

3神經膠質細胞

3.1神經膠質細星形膠質原性蛋白(S100β)是分子量為10.5 kD的酸性蛋白，是S100家族成員之一，由兩個β鏈亞基構成的二聚體，其氨基端和羧基端都含有疏水區，在亞基的羧基端含有一個EF手型鈣離子結合區，其基因定位于21號染色體。在神經系統，S100β主要集中在神經膠質細胞如星形膠質細胞、少突膠質細胞、雪旺氏細胞、室管膜細胞、腸神經膠質細胞、視網膜Müller細胞，在非神經組織也可存在如黑素細胞、朗格漢斯細胞、軟骨細胞、樹突狀細胞、淋巴器官、腎上腺髓質衛星細胞、睪丸間質細胞、骨骼肌衛星細胞〔31〕。有學者對人腦組織的研究顯示，在灰質中S100β蛋白陽性細胞主要是星形膠質細胞起主導作用，然而在白質則是由少突膠質細胞〔32〕。另有研究表明，對人類而言少突膠質細胞是S100β陰性細胞，但是在嚙齒類動物的少突膠質細胞里卻檢測到了S100β蛋白及其mRNA，鼠腦中的S100β蛋白則主要由少突膠質細胞表達〔33〕。對星形膠質細胞而言，S100β蛋白主要存儲于胞質和胞核中，而在小膠質細胞中，漫布于細胞質中，并與細胞內膜相連。S100β在表達GFAP的星形膠質細胞后的終端發育階段表達，當星形膠質細胞表達S100β，則細胞失去神經干細胞能力，說明S100β標記的細胞為細胞成熟的表現，若細胞長期暴露于表皮生長因子中，維持星形膠質細胞不成熟的狀態，S100β則不表達。S100β蛋白目前認為能發揮各種生物作用，包括蛋白質磷酸化的調節、細胞生長和運動、細胞周期、轉錄分化和細胞存活、細胞自分泌和旁分泌等。高濃度S100β濃度還能誘導軸突生長、刺激細胞增殖、星形膠質細胞微管蛋白激酶磷酸化，故認為S100β是一種神經營養因子并有助于神經元存活的蛋白質。

3.2星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(GFAP)分子量為50~52 kD，主要存在于中樞神經系統星形膠質細胞。編碼GFAP基因位于17q21，與其他中間絲序列尤其是結蛋白和波形蛋白的堿基序列具有較高的同源性，其中與結蛋白的同源性達65%，與波形蛋白的同源性達67%。星形膠質前體細胞主要表達Vimentin，而成熟之后表達Vimentin和GFAP，故GFAP被認為是星形膠質細胞成熟的標志物。有研究發現GFAP陽性細胞在產后小鼠和成年大鼠的中樞神經細胞中呈深染的不規則“星”狀，主要定位在星形膠質細胞的胞體和突起上，在前額皮質的分子層、外顆粒層和錐體細胞層、海馬和黑質中密集分布，紋狀體只有少量陽性細胞表達；在脊髓的灰、白質主要分布于脊髓中央管附近大量表達。在人腦中， GFAP最早出現于胚胎發育的第8周，逐漸表達于膠質細胞中，主要表達于星形膠質細胞中，而在室管膜細胞、少突膠質細胞等膠質細胞也有少量分布〔34〕。另外，GFAP還可表達在非中樞神經系統(CNS)細胞如許旺細胞、成纖維細胞、肝星狀細胞。GFAP蛋白作為成熟的星形膠質細胞中間絲的組成部分，具有調節細胞代謝、形成和維護血腦屏障、產生和釋放神經營養因子等作用，而且在維持星形細胞形態和功能上具有重要作用：如形成細胞核和細胞膜的連接、參與細胞骨架重組、黏附和穩定神經元的結構、維持腦內髓鞘形成并作為細胞信號轉導通路等。

3.3少突膠質細胞

3.3.1O1/O4有研究通過間接免疫熒光法觀察O1、O2、O3以及O4抗原標記產后早期的小鼠小腦、大腦、脊髓、視神經、視網膜細胞中發現在星形膠質細胞、神經細胞、成纖維細胞的表面都沒有檢測O抗體，而在少突膠質細胞的表面上檢測到，并且O抗原在小鼠、大鼠、雞和人類的中樞神經系統中均有表達〔35〕。O4及O1抗原均為少突膠質細胞標志物，均為膜表面的一種腦硫酯，O4既可以表達于晚期少突膠質細胞前體細胞，也可表達于未成熟少突膠質細胞，Q1主要表達于未成熟少突膠質細胞。O4陽性的細胞可以成為分化為成熟MBP陽性的少突膠質細胞，該細胞為GC陽性細胞(少突膠質前體細胞)，故可推測O4也特異性表達少突膠質前體細胞。幾乎所有的O4陽性的細胞在成熟的大腦皮質也表達NG2(膠質前體細胞)，而NG2陽性細胞的不表達OX-42單克隆抗體，說明O4/NG2陽性細胞不是小膠質細胞。Reynolds等〔36〕為了研究O4是否只在少突膠質細胞譜系表達，進行了O4和GFAP、NFP抗體免疫雙標檢測，發現O4在皮質灰質中的NFP陽性的神經元細胞、GFAP陽性的星形膠質細胞均不表達。因此，認為O4抗體和GC、NG2一樣，可作為少突膠質前體細胞的標志物，但還可標記未成熟少突膠質細胞，不標記神經元細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞；而O1僅為未成熟少突膠質細胞的標志物。

3.3.2少突膠質細胞因子(OLIG)是一個與堿性螺旋-環-螺旋結構轉錄因子家族，用Northern blot技術分析表明，OLIG1(2.2 kb)和OLIG2(2.4 kb)在大腦中特異性表達。在成年嚙齒動物腦組織，OLIG1/2在少突膠質細胞特異性表達，而在星形膠質細胞和神經元細胞不表達〔37〕。OLIG1和OLIG2位于鼠16號染色體，在人類位于21號染色體。這兩個基因起始于胚胎期脊髓腹側區域，在胚胎期神經管、脊髓、丘腦均有表達，成年后在胼胝體、腦白質、海馬中也可廣泛表達，但灰質表達很少〔38〕。OLIG2的分布要比OLIG1范圍廣，在腦室區(VZ)、SVZ橫向(LGE)區和內側神經節的E10.5到E14.5區，OLIG2均可呈陽性表達，而在這些細胞中很少表達OLIG1，這表明OLIG2的表達不限于少突膠質細胞系，在多種類型的神經元祖細胞中均可表達，包括多能神經元、神經膠質祖細胞。OLIG1在胚胎期位于少突膠質細胞及其前體細胞的細胞核中，出生后則由胞核遷移到胞質中，但在發生髓鞘損傷后OLIG1又出現在胞核內；而OLIG2始終存在于胞核中，不會發生遷移現象。利用基因轉染技術使OLIG1和OLIG2基因過表達，發現過度表達能增加少突膠質前體細胞的增殖和運動神經元前體細胞的產生，其中OLIG1作用于少突膠質細胞的成熟過程中；OLIG2在脊髓和后腦的軀體運動神經元發育過程中發揮作用，也參與少突膠質細胞的發育；OLIG1在發育的腦中能夠部分代償OLIG2的功能。

3.3.3髓鞘堿性蛋白(MBP)成熟少突膠質細胞的標志物，廣泛存在于少突膠質細胞及其髓鞘中的骨架蛋白中，具有四個主要類型，根據分子量分為21 500 kb,18 500 kb,17 000 kb,14 000 kb。人和鼠的MBP基因均位于第18號染色體遠端即18q22-23。MBP分中樞性和周圍性兩種，中樞性MBP由少突膠質細胞合成和分泌，在白質中含量最高，主要在少突膠質細內以共價鍵結合于髓鞘質漿膜面，同時也與細胞骨架、微管、微絲相連；周圍性MBP由雪旺細胞合成和分泌，存在于周圍神經髓鞘中；除了神經組織外，心、肝、腎、腎上腺、骨骼肌等器官組織中也存在，但含量很低，難以測出。在新生小鼠腦的神經膠質細胞培養中采用免疫熒光法和原位雜交的方法研究髓鞘堿性蛋白發育階段MBP基因的表達，大量MBP特異性mRNA在產后5~6 d不成熟少突膠質細胞內突然出現，在成熟過程中慢慢增加，約有60%~80%的細胞可表達MBP，但在神經元細胞中沒有表達。有研究〔39〕用雙重標記的方法發現，在小鼠產后8~9 d，MBP陽性表達在少量GC陽性的細胞，在產后10~13 d，所有的GC陽性細胞均MBP標記陽性，在產后13~14 d的細胞培養中MBP標記的細胞比例最高，GC是特異性不成熟的少突膠質細胞的標志物，MBP在GC陽性后的細胞表達，有力地說明MBP表達成熟少突膠質細胞。因此，認為MBP特異性標記少突膠質細胞，而非神經元細胞。

3.3.4少突膠質細胞特異性抗體(RIP)有研究用免疫組化的方法發現RIP陽性細胞的主要分布在小鼠脊髓和小腦少突膠質細胞髓鞘的軸突。此外，分別利用RIP和MBP、GFAP免疫雙標細胞標記實驗表明，RIP在MBP陽性的細胞染色，而在GFAP陽性的細胞不染色，表明RIP選擇性染色少突膠質細胞，非星形膠質細胞〔40〕。

3.4小膠質細胞

3.4.1CD11b單克隆抗體(OX42)特異性標記小膠質細胞，因能識別鼠的CR3受體，CR3受體位于小膠質細胞的分支，故OX42抗體特異性標記小膠質細胞。在正常成年腦組織中，小膠質細胞處于靜息狀態，胞體很小，突起很細，OX42染色呈陰性或弱陽性，稱之為“靜息型”小膠質細胞。當機體受到某種刺激(如外傷、感染、物理化學或電刺激)后小膠質細胞被激活，早期胞體變大、突起變粗、棘明顯清晰，OX42 染色較深成為早期反應狀態，稱之為“早期反應型”小膠質細胞。隨著刺激灶的存在，小膠質細胞的胞體進一步肥大，突起回縮變短，而成為巨噬細胞樣的“吞噬型”小膠質細胞。在孟凡超等〔41〕的研究中發現，在年輕組、老年組正常腦組織切片中沒有OX42的陽性小膠質細胞，而在大鼠腦出血組中，老年組活化的OX42陽性的小膠質細胞明顯增多，而且多于年輕組。故認為OX42單克隆抗體在正常小膠質細胞染色淺或無，而在非正常小膠質細胞染色多或深。

3.4.2離子鈣結合銜接分子1(IBA-1)是一個EF手型蛋白，特異性表達單核細胞譜系，如小膠質細胞。IBA-1是一個具有肌動蛋白屬性進化的保守蛋白，已發現與F-肌動蛋白存在共定位，在巨噬細胞集落刺激因子的膜褶皺樣運動和吞噬作用中發揮重要作用。IBA-1在人、猴、馬、大鼠和小鼠組織的小膠質細胞均有發現。有研究用免疫細胞化學和激光共聚焦顯微鏡的方法檢測IBA-1蛋白只存在小膠質細胞、腦脊膜、室管膜的巨噬細胞和脈絡叢淺表的基質細胞的巨噬細胞中表達，而這些細胞均具有吞噬功能，小膠質細胞為巨噬細胞的一種，進一步證實IBA-1在中樞神經系統中特異性表達于小膠質細胞。因IBA-1在小膠質細胞含量豐富且穩定，故認為是小膠質細胞的可靠的特異的標志物。另外，IBA-1也是同種異體移植炎癥因子-1(AIF1)，還可在造血細胞中表達〔42〕。

4總結

除上述神經細胞的生物標志物外，還有文獻報道配對盒蛋白-6(Pax-6)、Sox-2也可特異性標記神經前體細胞；無調同源物1(ATOH1)、前神經轉錄因子(ASH1)、發狀分裂相關增強子-5(HES-5)、HU抗原(HuC、HuD)、神經球胚體(EB)、L1神經黏附分子可特異性標記神經元細胞；抗星形膠質細胞抗體、水通道蛋白-4(AQP4)、發狀分裂相關增強子-1(HES-1)可以特異性標記星形膠質細胞；Nogo A特異性標記少突膠質細胞；Coronin-1a特異性標記小膠質細胞，但是這些特異性的標志物的可靠性有待進一步證實與取證。不同種類神經細胞譜系可有多個生物標志物，如可標記少突膠質細胞譜系的生物標志物有：A2B5、GC、NG2、O4、O1、OLIG、RIP、MBP，分別在少突膠質前體細胞、未成熟少突膠質細胞、成熟少突膠質細胞階段依次標記，這有利于觀察特定細胞在不同發育階段的表達。

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〔2014-03-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)