Klotho蛋白與血管內皮關系研究進展

Klotho蛋白與血管內皮關系研究進展

林雅軍胡剛魏潔

(衛生部北京醫院衛生部北京老年醫學研究所，北京100730)

關鍵詞〔〕Klotho蛋白；衰老；血管內皮細胞

中圖分類號〔〕R592〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：林雅軍(1976-)，男，博士，副研究員，主要從事細胞衰老研究。

血管內皮功能失調是諸多心血管疾病發生、發展的始動因子。冠心病患者及糖尿病患者血管內皮功能明顯受損〔1，2〕。研究〔3〕發現Klotho(KL)基因缺陷小鼠的動脈發生類似人類動脈粥樣硬化樣病理變化及人類早衰樣癥狀。本文探討KL基因與血管內皮功能的關系及二者對老年相關疾病的影響。

1KL基因和蛋白的特征

KL是以希臘紡織生命線的女神命名的，是1997年Kuro-o〔4〕從一個基因突變小鼠發現的，此種小鼠表現出類似人類早衰綜合征樣的多種異常表型。人和小鼠KL基因定位于染色體13q12區域，大鼠則定位于染色體12q12區域。KL基因全長約50kb，包括5個外顯子和4個內含子。在KL基因結構中存在一個潛在的可變剪切位點，這一位點如果接受了一個50bp片段的插入，該插入序列末尾的兩個核苷酸TA就會與外顯子4的第一個核苷酸G共同構成一個終止密碼TAG，使得DNA由此截斷形成一個短的開放閱讀框，僅含有3個外顯子，編碼分泌型KL蛋白。但如果可變剪切位點沒有50bp片段的插入，其將編碼具有1 014個氨基酸的模型KL蛋白。人膜型KLcDNA全長3 036bp、分泌型cDNA全長1 647bp；小鼠和大鼠膜型KLcDNA長度相同為3 042bp，小鼠分泌型為1 650bp，而大鼠無分泌型。人與小鼠的KLcDNA有80%的同源、與大鼠有83%的同源〔5〕。

KL蛋白的細胞外區域由KL1和KL2兩個同源區域構成。每一個區域與哺乳動物乳糖-皮根苷水解酶同源，與細菌和植物的β-糖苷酶同源〔2〕。其具有外切糖苷酶活性，能夠水解糖類、糖蛋白和糖脂β-糖苷鍵。通過一個未知的酶切掉細胞外區域(帶有或不帶質膜區域)產生KL蛋白的分泌型，其存在血液、尿液和腦脊液。另外，如果在第三個外顯子處發生切割會產生僅僅包含KL、而KL跨膜區和胞內區缺失的另一種分泌型的KL蛋白〔6〕。因此，KL基因至少產生3種蛋白：膜型和兩個分泌型，也就是膜型KL蛋白脫落產生的整個胞外功能區，和由選擇性剪切酶剪切形成的胞外功能區。

KL基因在有限的組織中表達，主要在腎臟遠曲小管和腦脈絡膜表達。在腦垂體、甲狀旁腺、胰腺、睪丸、卵巢、胎盤、骨骼肌、膀胱、結腸和內耳中也表達〔5〕。在KL基因突變小鼠(轉基因純和小鼠)，KL基因表達受到抑制，表明在KL基因5′端進行的插入突變產生一個嚴重的下效等位基因〔4〕；并且通過常規基因靶向處理能夠產生無效等位基因〔7〕。無效等位基因的純合子(KL-/-)小鼠表現出與下效等位基因純合子小鼠(KL突變小鼠)相同的衰老表型。KL-/-小鼠和KL基因突變小鼠在本文中通稱為KL基因缺陷小鼠。

2KL基因缺陷小鼠血管內皮改變

KL基因缺陷小鼠能夠正常生長到3w，并且在外形上與其同窩野生型小鼠沒有顯著差別。然而，從3w起直至其8～9w后死亡，其停止生長。盡管在發育過程中出現多種類似人類衰老的異常，但是至今沒有發現其特殊的死因〔4〕。

KL基因缺陷的小鼠在出生4w后即可出現動脈硬化，并隨增齡而加重，表現為主動脈嚴重鈣化，肌性中動脈中層鈣化、內膜增厚，腎臟小動脈嚴重鈣化等，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性正常KLcDNA轉導給KL基因缺陷小鼠后，其動脈硬化程度可得到顯著改善〔8〕。

組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)和其抑制劑(PAI)-1是纖溶系統的主要成分，是纖溶系統關鍵性調節物質，在纖溶系統的活化過程中占有重要的地位。兩者之間的動態平衡對維持正常的血液流動有著重要意義。兩者失衡將導致出血或血栓形成。成小苗等〔9〕研究發現，與野生型小鼠相比，KL基因缺陷小鼠血漿活化PAI-1抗原和多種組織PAI-1mRNA水平顯著提高。升高的PAI-1與年齡和異位鈣化進展及腎臟腎小球纖維沉積相關。免疫組化檢測發現PAI-1mRNA在腎小管內皮細胞，心肌細胞，腎上腺髓質細胞和M?nckeberg動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞和內皮細胞轉錄水平顯著升高。

血管內皮作為循環血液與血管平滑肌之間的中介組織，除具有天然屏障作用外，還具有調節血管張力、參與血管腔內止血過程和調控血管平滑肌增殖的功能。這些功能是通過血管內皮細胞分泌的一系列血管活性物質實現的。一氧化氮(NO)為主要的舒張松弛因子，內皮素(ET)為主要的縮血管因子，這兩類活性物質相互對立又相互聯系，共同維持血管及血液內環境的平衡。Maekawa等〔10〕觀察到KL基因缺陷小鼠依賴乙酰膽堿的主動脈舒張功能較野生型明顯下降，證實了KL基因缺陷小鼠內皮源性NO較野生型生成減少，NO合成減少可能是KL基因缺陷小鼠易發生動脈硬化的原因。RT-PCR檢測表明血管內皮細胞中無KL基因表達，推測KL基因維持血管內皮細胞分泌NO可能是通過其分泌型的KL蛋白或者由KL蛋白介導的循環因子來實現的。為驗證這一推測，研究進行了KL基因缺陷小鼠與野生型的聯體結合試驗，在聯體飼養2w后發現主動脈的舒張功能明顯增強，4w后主動脈和提睪肌動脈的舒張功能趨于正常，與野生型無明顯差異，進一步證實了KL蛋白作為循環因子與血管內皮細胞失調的相關性〔10，11〕。在隨后的研究中以存在多種動脈硬化危險因素的自發性2型糖尿病(OLETF)大鼠為研究對象，經腺病毒將KL基因導入OLETF大鼠后可改善內皮細胞功能，增加內皮細胞的NO合成，同時還具有減輕血管周圍組織纖維化、逆轉血管重構、降低血壓的作用，而這些對減輕動脈硬化都有重要作用。以上研究均表明KL基因與內皮功能失調、NO合成及動脈硬化存在因果關系。鑒于KL基因在動脈硬化發病中的重要作用，補充KL蛋白或者針對KL基因的治療可能在改善動脈硬化方面有益。

Fletcher等〔12〕研究發現成纖維細胞生長因子(FGF)-21治療OLETF大鼠10w后，血管內皮細胞NO合成增加，腎臟KL基因的表達上調，血糖、血壓、血脂等代謝紊亂得到改善，分析原因可能與腎臟具有豐富的KL基因表達和曲格列酮治療可減輕腎臟損害有關，但是否直接通過上調KL基因表達而出現上述作用還不明確。Masuda等〔13〕在基因補救治療方面做了進一步研究，他們在KL基因缺陷小鼠中導入了可被鋅誘導的KL基因表達系統，該系統融合了一個金屬硫蛋白-1啟動子的外源性KL基因，可在鋅誘導下表達KL基因。研究發現，經過鋅水飼養后KL基因缺陷小鼠的動脈粥樣硬化損傷可逐漸減輕，經過11w后原損傷可完全消失，以上實驗證明了基因補救治療的有效性。

3KL蛋白對內皮細胞保護作用的機制

KL蛋白主要參與體內鈣磷代謝，維持體內鈣磷平衡，此外，其還參與胰島素抗性過程和對活性氧物質的抗性等〔14〕，而其對血管內皮的功能主要包括以下方面：

3.1抗炎KL蛋白能夠抑制由腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)黏附分子(ICAM)-1和血管細胞黏附分子(VCAM)-1的表達及核因子(NF)-κB活性和人NF-κB抑制蛋白(IKB)磷酸化。而且KL蛋白能夠逆轉TNF引起的內皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化抑制。KL蛋白能夠抑制單核細胞黏附于HUVEC，在大鼠主動脈器官培養中抑制黏附分子表達〔15〕。

3.2抗氧化KL蛋白能夠通過激活環磷酸腺苷(cAMP)信號通路和促進NO生成來增加錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的表達，同時發現KL蛋白能夠抑制血管緊張素Ⅱ誘導的HUVEC中活性氧(ROS)生成〔16〕。另有報道KL蛋白能夠通過CAMP-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號通路增加血管緊張素Ⅰ轉換酶活性〔17〕。

3.3抗凋亡研究發現KL蛋白過度表達能夠減少過氧化氫(H2O2)誘發的SV40轉化的非洲綠猴骨細胞(COS)-1和Jurkat細胞凋亡，能夠減少H2O2和依托泊苷誘導的HUVEC凋亡。通過SA-β-gal染色發現KL蛋白能夠干預H2O2誘發的細胞早衰。證實經重組KL蛋白處理人臍靜脈內皮細胞后，其Caspase-3和Caspase-9的活性明顯下降，而p53和p21表達也下調，提示KL蛋白有抗衰老和細胞凋亡的作用。由于內皮細胞衰老和凋亡是動脈硬化的重要環節，可見KL基因還可通過抑制內皮細胞衰老和凋亡而防止動脈硬化〔18〕。Carracedo等〔19〕曾也在內皮細胞中觀察到KL蛋白有抗凋亡和氧化應激的作用。

3.4促進血管生成對單側下肢缺血的KL基因缺陷小鼠模型進行激光多普勒血流分析表明，KL基因缺陷小鼠缺血與正常的激光多普勒血流比例減少。主動脈環培養分析表明KL基因缺陷小鼠血管生成受損，并伴隨內皮來源的NO釋放減少。而且與野生型小鼠比較，移植同源骨髓細胞摻入缺血組織毛細血管的比率降低，伴隨骨髓和外周血中c-kit+CD31+內皮祖細胞(EPC)樣的單核細胞減少。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑——西立伐他汀和匹伐他汀能夠恢復KL基因缺陷小鼠新生血管的損傷，伴隨骨髓和外周血中c-kit+CD31+細胞增加，并且增加主動脈環培養中的血管生成〔20，21〕。

研究表明人類KL基因多個單核苷酸多態性(SNP)位點與動脈硬化性疾病相關，如KL基因C1818T多態性CT基因型與老年人特別是老年男性的急性冠脈綜合征發病存在相關性〔22〕；KL基因395A等位基因與動脈硬化呈負相關；對79歲以上的人群研究發現，KL-VS等位基因雜合子的5年生存率較高，提示雜合子更具有長壽優勢。同時發現高密度脂蛋白膽固醇和收縮壓同KL-VS基因型有關，雜合子發生腦卒中的風險性較低，純合子發生腦卒中的風險性最高。總之，KL蛋白能夠通過抗炎、抗氧化、抗凋亡和促進血管生成等方面作用保護血管內皮免受有害因子的損傷，預防動脈粥樣硬化的發生，有望減少老年人心腦血管疾病的發生率和病死率。

4參考文獻

1李韜，方朝暉.糖尿病血管內皮損傷機制研究進展〔J〕.中醫藥臨床雜志，2010；22(3)：275-7.

2BanksK，PuttaguntaD，MurphyS，et al.Clinicalcharacteristics，vascularfunction，andinflammationinwomenwithanginaintheabsenceofcoronaryatherosclerosis：theDallasHeartStudy〔J〕.JACCCardiovascImaging，2011；4(1)：65-73.

3蘭丹鳳，楊秋萍.Klotho與2型糖尿病并動脈粥樣硬化關系的研究進展〔J〕.醫學綜述，2011；17(13)：1998-2000.

4Kuro-oM.Klothoandtheagingprocess〔J〕.KoreanJInternMed，2011；26(2)：113-22.

5袁丹，陳海平.抗衰老Klotho基因的功能及與人類疾病的關系〔J〕.中國老年學雜志，2010；30(14)：2074-76.

6Kuro-oM.Klothoasaregulatorofoxidativestressandsenescence〔J〕.BiolChem，2008；389(3)：233-41.

7TangriN，AlamA，WootenEC，et al.LackofassociationofKlothogenevariantswithvalvularandvascularcalcificationinCaucasians：acandidategenestudyoftheFraminghamOffspringCohort〔J〕.NephrolDialTransplant，2011；26(12)：3998-4002.

8IkushimaM，RakugiH，IshikawaK，et al.Anti-apoptoticandanti-senescenceeffectsofKlothoonvascularendothelialcells〔J〕.BiochemBiophysResCommun，2006；339(3)：827-32.

9成小苗，周巧玲，林書典，等.自發性高血壓大鼠Klotho與MMP-9，TIMP-1和PAI-1基因的表達及福辛普利和纈沙坦對其的干預作用〔J〕.中南大學學報(醫學版)，2010；35(10)：1048-56.

10MaekawaY，OhishiM，IkushimaM，et al.Klothoproteindiminishesendothelialapoptosisandsenescenceviaamitogen-activatedkinasepathway〔J〕.GeriatrGerontolInt，2011；11(4)：510-6.

11胡興文，田小春，馬厚勛.Klotho基因及其與心血管疾病關系研究進展〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2011；5(23)：7000-1.

12FletcherJA，MeersGM，LaughlinMH，et al.Modulatingfibroblastgrowthfactor21inhyperphagicOLETFratswithdailyexerciseandcaloricrestriction〔J〕.ApplPhysiolNutrMetab，2012；37(6)：1054-62.

13MasudaH，ChikudaH，SugaT，et al.Regulationofmultipleageing-likephenotypesbyinducibleKLgeneexpressioninKlothomutantmice〔J〕.MechAgeingDev，2005；126(12)：1274-83.

14宋雙雙，司良毅.抗衰老klotho基因的研究新進展〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2011；13(8)：760-1.

15MaekawaY，IshikawaK，YasudaO，et al.KlothosuppressesTNF-alpha-inducedexpressionofadhesionmoleculesintheendotheliumandattenuatesNF-kappaBactivation〔J〕.Endocrine，2009；35(3)：341-6.

16RakugiH，MatsukawaN，IshikawaK，et al.Anti-oxidativeeffectofKlothoonendothelialcellsthroughcAMPactivation〔J〕.Endocrine，2007；31(1)：82-7.

17BernheimJ，BenchetritS.ThepotentialrolesofFGF23andKlothointheprognosisofrenalandcardiovasculardiseases〔J〕.NephrolDialTransplant，2011；26(8)：2433-8.

18YangK，NieL，HuangY，et al.Ameliorationofuremictoxinindoxylsulfate-inducedendothelialcelldysfunctionbyKlothoprotein〔J〕.ToxicolLett，2012；215(2)：77-83.

19CarracedoJ，BuendíaP，MerinoA，et al.Klothomodulatesthestressresponseinhumansenescentendothelialcells〔J〕.MechAgeingDev，2012；133(11-12)：647-54.

20ShimadaT，TakeshitaY，MuroharaT，et al.Angiogenesisandvasculogenesisareimpairedintheprecocious-agingKlothomouse〔J〕.Circulation，2004；110(9)：1148-55.

21張月蘭，田文，張子新，等.匹伐他汀對Klotho基因敲除雜合子小鼠血管新生的促進作用〔J〕.中國應用生理學雜志，2006；22(2)：163-71.

22劉曉林，田小春，馬厚勛.Klotho及其基因多態性與衰老相關性疾病關系研究進展〔J〕.國際老年醫學雜志，2010；31(3)：105-9.

〔2013-12-17修回〕

(編輯杜娟)