尼帕病毒的診斷技術研究進展

（貴州省畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 555000）

尼帕病毒的診斷技術研究進展

吳玙彤，謝麗麗

（貴州省畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 555000）

尼帕病毒病是嚴重危害人類與養豬業的一種較新的人畜共患病。文章中著重闡述了近年來在其實驗室診斷技術方面的研究進展，以期為該病的深入研究提供參考。

尼帕病毒；豬；實驗室診斷

尼帕病毒病(NVD)是由尼帕病毒引起的一種新的人畜共患病毒性疾病，于1997年在馬來西亞森美蘭洲雙溪尼帕城首次發現[1]，是繼瘋牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各國廣泛關注和恐慌的人畜共患病。生豬感染該病毒后，出現發熱、呼吸困難及腦炎癥狀；母豬感染該病毒后表現為共濟失調等神經癥狀，可能會導致流產或突然死亡；人感染該病毒后發生病毒性腦炎而死亡[2]。由于其引起人感染后的高死亡率，缺乏有效的疫苗和治療方法，因此世界動物衛生組織(OIE)和我國農業部都將其列為生物安全4級病原體。

1 概況

尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒屬(Henipavi rus)的尼帕病毒(NiV)引起的一種人畜共患傳染病。NiV是新發現于蝙蝠的一種副黏病毒，1999年3月初，從Sungai Nipah村1名腦炎患者的腦脊液中分離到了一種新的副黏病毒，并確定為該次暴發的病原，因此命名為尼帕病毒(Nipah virus)[3]。血清學檢測顯示，家養動物如狗、貓、馬和山羊均可感染尼帕病毒，但豬是其他家養動物的傳染源[4]。尼帕病毒可感染不同年齡的豬，從1998年馬來西亞暴發尼帕病毒病以來，已造成許多人和豬傷亡，引起了巨大的社會恐慌，并給養豬業造成嚴重的經濟損失。

2 實驗室診斷技術

2.1 病原學檢測

2.1.1 NiV分離鑒定

NiV能夠在多種培養細胞中生長并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細胞和兔腎細胞RK-13細胞系對NiV尤為敏感。通常在病毒感染3 d內能夠觀察到病毒病變效應(CPE)，但一般來說在細胞上傳代2次，每次5 d所達到的分離效果更為穩定。經低毒量穩定傳代后的病毒再次感染細胞后24～48 h，細胞出現以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細胞核位于合胞體中央，而晚期則被運送至合胞體外，并聚集在其周圍[5]。由于NiV在體外細胞培養中擴增迅速，并且能產生大量的病毒抗原，所以采用免疫熒光或免疫電鏡法檢測分離培養該病毒，最為方便快速。

2.1.2 分子診斷技術

NiV的基因組全序列已被測出[6]，研究者們可以在此基礎上針對NiV的分子診斷技術進行相應的研發。目前，已經被報道的針對NiV的分子檢測技術有2種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。

2.1.2.1 熒光定量RT-PCR

該方法敏感度高、特異性強，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優勢。其檢測靈敏度可以達到1個空斑形成單位 （PFU）[7]，并且有被學術界普遍認可的相關引物和探針有：

5′－TCAGCAGGAAGGCAAGA GAGTAA－3′（Primer1），

5′－CCCCTTCATCGATATC TTGATCA－3′（Primer2），

5′－6FAM－CCTCCAATGAG CACACCTCCTGCAGTAMRA－3′（TaqMan probe），為NiV的實驗室快速診斷提供了技術支持。

2.1.2.2 雙重套式RT-PCR：

Wacharapluesadee等描述了一種帶有內參的雙重套式RT-PCR檢測技術。該技術能夠用于對果蝠尿樣的檢測，并且加入內參大大降低PCR相關的抑制因素帶來的假陰性的結果，提高檢出準確率，在NiV流行病學調查時大大提高NiV監測數據的可靠性。

2.1.3 其他診斷技術

主要針對NiV全病毒抗原或病毒主要致病抗原（如F蛋白和G蛋白等）制備特異性的病毒抗血清或單克隆抗體，在此基礎上建立病毒中和試驗、免疫組化以及免疫熒光等方法檢測NiV相關抗原。病毒中和試驗主要包括傳統的空斑抑制試驗、微孔板中和試驗以及免疫空斑試驗3種，分別通過計算空斑形成單位（PFU）、組織培養半數感染量（TCID50）以及病灶形成單位（FFU）達到檢測病毒抗原或抗體的目的。檢測NiV的病毒中和試驗需要在BSL4級生物實驗室進行，但近年來研究者們陸續開發了幾種實驗室檢測技術，能夠將檢測NiV的生物安全水平降低至BSL2級，為偏遠地區NiV檢測提供了幫助。由于NiV原發于血管內壁，所以病死畜的多個器官均可用于免疫組化的檢測，尤其是肺臟。

目前，研究者們已經針對NiV的免疫組化法檢測研發了幾個檢測體系，為該病毒的實驗室檢測提供了技術支持。

2.2 血清學檢測

鑒于NiV的生物危害性，用于該病毒血清學診斷的所有血清樣品必需進行安全化處理，以盡量減少實驗室工作人員接觸NiV的風險。可以用6 kGy的γ射線輻照或含0.05% Tween20和0.5% Triton—X100 PBS（磷酸緩沖液） 1/5 稀釋后56 ℃ 30 min滅活的方法對血清樣品進行前處理。目前常用的NiV的血清學檢測方法包括病毒中和試驗和ELISA試驗。

2.2.1 病毒中和試驗

目前針對NiV抗體檢測的病毒中和試驗已經有相關的標準方法，Kaku等人利用基因重組技術構建了共表達NiV F或G蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測NiV血清樣本，用該重組病毒作為已知病毒抗原的好處在于GFP是可見的，可以在熒光顯微鏡下直觀地數出熒光斑點的數量而獲知血清樣品中NiV特異性抗體的含量。該方法要比傳統的中和試驗更為迅速、安全和靈敏。Tamin同樣也利用基因重組技術構建了單獨表達F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，檢測NiV抗體，并在此基礎上建立了檢測NiV抗體的空斑抑制試驗。

2.2.2 ELISA

目前，針對NiV抗體檢測的ELISA技術已經開發出間接ELISA和捕獲ELISA 2種。Daniels在1999年召開的國際豬病監測會議中提出了一種用非離子去污劑處理NiV感染的細胞以獲得ELISA檢測用NiV抗原的方法，隨后，為消除ELISA的非特異性，研究者們又在此基礎上加入了非感染細胞作為對照。美國疾病控制中心開發出能夠檢測針對NiV IgG和IgM 2種亞型免疫球蛋白的ELISA技術。此外，Yu等人也報道過用NiV N蛋白作為病毒抗原檢測IgG和IgM 2種亞型免疫球蛋白的ELISA方法。

3 防控措施

目前對該病尚無有效的藥物和治療方法，只能采取強制措施，監測并淘汰患病動物，以免傳染給人；防止家豬與野豬的接觸；禁止運輸和進口患病豬及其肉制品；對豬舍進行消毒，搞好清潔衛生工作。人感染后，用廣譜抗病毒藥Ribavirin(利巴韋林)，可減少發燒時間，緩解發病程度，降低急性腦炎死亡率。隨著科學家對這一病原的不斷了解，人們利用皰疹病毒為載體進行F、G融合蛋白克隆，并在大腸桿菌中進行表達，有可能用來防治尼帕病毒的感染，其他相關的疫苗正在研究開發中。

[1] 陳繼明，王志亮，趙永剛，等.2004年孟加拉尼帕病毒病疫情簡介[J].中華傳染病雜志， 2005，23(2)：144.

[2] 包世俊，扈榮良.豬的副黏病毒病簡介[J].中國獸醫科技，2002，32(10)：44-46.

[3] Chua K B，Goh K J，Wong K T，et al.Fatal encephalitis due to nipah virus among pig farmers in malaysia[J]. Lancet，1999(354)：1257-1259.

[4] Tan K S，Tan CT，Goh K J.Epidemiological aspects of Nipah virus infection[J].Neurol J Southeast Asia ，1999(4)：77-81.

[5] Hyatt A D，Zaki S R， Goldsmith C S，et al.Ultrastructure of Hendra virus and Nipah virus within cultured cells and host animals[J].Microbes and infection，2001，3(4)：297-306.

[6] Wang L，Harcourt B H，Yu M，et al.Molecular biology of Hendra and Nipah viruses[J].Microbes Infect，2001(3)：279-287.

[7] Guillaume V，Lefeuvre A，Faure C，et al.Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR(TaqMan)[J]. J Virol Methods，2004(120)：229-237.

；2015-09-17)