李俊麗　范琰琰　葉光華　林刻智　董繆武　喻林升*

（浙江省溫州醫科大學 法醫學系 司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州 325035）

TCMC在慢性肺動脈高壓肺血管重塑中的作用及色甘酸鈉的影響

李俊麗范琰琰葉光華林刻智董繆武喻林升*

（浙江省溫州醫科大學 法醫學系 司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州 325035）

目的 探究TCMC對慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及色甘酸鈉的影響。方法建立慢性低氧高二氧化碳肺血管重塑模型，分為三組：Ⅰ組（常氧空白對照組），Ⅱ組（低O2高CO2實驗組），Ⅲ組（色甘酸鈉實驗組）。Ⅲ組給予色甘酸鈉腹腔注射處理。光鏡下、透射電鏡下觀察肺動脈血管壁及其周圍肥大細胞超微結構形態學改變，甲苯胺藍染色法和免疫組織化學法對肺動脈周圍的肥大細胞及其脫顆粒狀態進行定性定量測定，免疫組織化學法（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）測定肺動脈平滑肌內PCNA蛋白表達，并用SPSS17.0軟件對數據進行處理。結果①Ⅱ組肺細小動脈管壁/管總面積（WA/TA）、管腔/管總面積（EA/TA）均高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組（P＜0.05）。②電鏡下，Ⅱ組肺細小動脈中膜平滑肌增生，外膜膠原纖維密集，內彈力板扭曲，內皮細胞突起，血管外肥大細胞內顆粒減少，胞膜不完整，Ⅲ組血管結構基本正常，平滑肌增生及膠原增生較Ⅱ組輕，肥大細胞膜完整。③Ⅱ組甲苯胺藍染色肥大細胞細胞數（NMC）、肥大細胞脫顆粒率（DR）及類胰蛋白酶陽性細胞數（TBS）高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組（P＜0.05）。結論①MC參與慢性低O2高CO2導致的大鼠肺血管重塑的過程。②色甘酸鈉可抑制慢性低O2高CO2導致的大鼠肺血管重塑改變。

慢性低O2高CO2；肥大細胞；肺動脈；色甘酸鈉

慢性低氧性肺動脈高壓（hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發展到肺心病的關鍵環節，而慢性低氧性肺動脈高壓的主要發病則是低氧引起的肺血管重塑。引起肺血管重塑的重要病理學基礎是肺動脈平滑肌細胞增生，血管膠原沉積，管壁增厚，因此，抑制肺動脈平滑肌細胞的增生作用，從而逆轉肺血管重塑，減輕低氧性肺動脈高壓成為研究的重要課題。近年來，炎癥以及肥大細胞（mast cell，MC）參與形成并維持肺動脈高壓的機制研究得到廣泛重視［1-2］。肺中含MC豐富，其分為兩類，一類是僅含類胰蛋白酶（Tryptase）的（TMC型），另一類是含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶（Chymase）的（TCMC型）。本實驗在以往的研究基礎上進一步探究，TCMC對慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及色甘酸鈉影響，以及MC在這一機制中的意義。

1　材料與方法

1.1材料：雄性SD大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供；兔抗大鼠TBS抗體、Ki67抗體及SABC試劑盒購自北京中杉金橋，姜黃素購自Sigma公司，其余試劑均為市售分析純。

1.2模型建立：從溫州醫科大學實驗動物中心購得180～200 gSD（Sprague-Dawley）雄性大鼠18只，普通清潔級動物實驗室內適應性飼養3 d，室內溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，隨機分為4組：Ⅰ組（常氧空白對照組），Ⅱ組（低O2高CO2實驗組），Ⅲ組（色甘酸鈉實驗組）。低氧氧艙內O2濃度為8%～11%，CO2濃度為3%～5%（氧艙內水蒸汽用無水氯化鈣吸收）。Ⅰ組常氧下正常飼養4周，Ⅱ、Ⅲ組同樣飼養4周，但給予每周6 d，每天8 h置于低氧氧艙中的處理，Ⅲ組入艙前給予色甘酸鈉腹腔注射處理。

1.3肺細小動脈顯微結構觀察：放血處死大鼠后，取肺葉組織，10%福爾馬林溶液固定，脫水透明，浸蠟包埋，石蠟組織切片（4 μm），HE染色后，光鏡下觀察肺細小血管顯微結構并拍照。每張切片中選取5支直徑100～200 μm肺動脈，利用圖像分析系統（IPP6.0）測定肺細小動脈管壁/管總面積（vessel wall area/total area，WA/TA）、管腔/管總面積（vessel cavity area/total area，EA/TA）。

1.4電鏡觀察肺小動脈超微結構：取肺門處肺動脈周圍組織0.1 cm× 0.1 cm×0.1 cm組織塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇、丙醇梯度脫水，EPON812包埋，固化，LKB-V型超薄切片機切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察肺小動脈壁周圍肥大細胞及其內皮細胞、內彈力板、平滑肌細胞、成纖維細胞、膠原增生情況，并拍照記錄。

1.5甲苯胺藍染色肥大細胞測定：石蠟包埋組織切片（4 μm），二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，甲苯胺藍染色，脫水，中性樹膠封固。光鏡下觀察，肺細小血管周圍甲苯胺藍染色陽性肥大細胞，每張切片隨機選取5個含肺細小動脈高倍鏡視野，計數個視野中肥大細胞細胞數（the number of mast cell，NMC），肥大細胞均數=每組肥大細胞總數/所取視野數；肥大細胞脫顆粒率（degranulation rate，DR）=脫顆粒肥大細胞數/肥大細胞總數。

1.6類胰蛋白酶酶（TBS）的免疫組化法檢測：石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，常溫下3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，微波熱修復抗原活性，進口山羊血清封閉常溫20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素核復染，陽性細胞呈棕黃色。每張切片隨機選取5個含肺細小動脈高倍鏡視野，計數個視野中陽性細胞數。

1.7肺細小動脈平滑肌內PCNA（Ki67）蛋白表達：石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，常溫下3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，高壓熱修復抗原10 min，進口山羊血清封閉常溫20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素核復染，陽性細胞呈棕黃色。每張切片隨機選取5個含肺細小動脈高倍鏡視野，觀察各組血管平滑肌細胞Ki67表達。

2　結　果

2.1大鼠肺小動脈顯微結構觀察：肺組織經HE染色光鏡下觀察，低O2高CO2組相比正常組肺細小動脈管壁明顯增厚，平滑肌細胞增生，內彈力板扭曲明顯，管腔狹窄，同時低O2高CO2組管壁/管總面積（WA/ TA）、（EA/TA）比正常組明顯增高（P＜0.05）；色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肺動脈管壁未增厚，平滑肌細胞未見明顯增生，內彈力板自然彎曲，管腔未見明顯改變，同時兩組管壁/管總面積（WA/TA）都比低O2高CO2組降低（P＜0.05）。

2.2肺細小動脈超微結構觀察：電鏡下，正常組血管結構正常，平滑肌細胞及膠原未增生，內彈力板自然彎曲，內皮細胞扁平，肥大細胞膜完整；低O2高CO2組肺細小動脈中膜平滑肌增生，外膜膠原纖維密集，內彈力板扭曲，內皮細胞突起，血管外肥大細胞內顆粒減少，胞膜不完整；姜黃素組、色甘酸鈉組血管結構基本正常，平滑肌增生及膠原增生較低O2高CO2組輕，肥大細胞膜完整。

2.3肥大細胞甲苯胺藍染色情況：顯微鏡下觀察可見肺細小動脈周圍肥大細胞內粗大顆粒染成紫紅色，未脫顆粒細胞胞膜完整，胞質染色加深，脫顆粒細胞形態不規整，胞質淡染。低O2高CO2組相比正常組肺細小動脈周圍肥大細胞數量明顯增多（P＜0.05），脫顆粒率增高（P＜0.05）；色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肥大細胞數量較少（P＜0.05），脫顆粒率降低（P＜0.05）。

2.4肥大細胞類胰蛋白酶（TBS）免疫組化檢測：光鏡下可見，肺細小動脈周圍肥大細胞胞質染成棕黃色，低O2高CO2組相比正常組肺細小動脈周圍肥大細胞細胞數明顯增多（P＜0.05）；姜黃素組、色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肥大細胞細胞數明顯減少（P＜0.05）。

2.5肺細小動脈平滑肌內PCNA（Ki67）蛋白表達：光鏡下，免疫組化法檢測肺細小動脈平滑肌細胞Ki67，Ⅰ組呈陰性，Ⅱ組則可見部分陽性細胞表達，Ⅲ組呈弱陽性。

3　討　論

慢性低氧性肺動脈高壓是一個有著高發病率和病死率的慢性呼吸系統疾病，其病理學改變的研究已十分清楚，主要是低氧引起的肺血管平滑肌細胞和內膜內皮細胞增生，細胞外基質分泌增多，血管壁增厚，導致肺血管重塑，肺動脈壓力增高［3］。低氧刺激肥大細胞激活并脫顆粒，顆粒中含有大量細胞因子和酶類，其中類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、MMPs、VEGF與低氧下肺血管增生和肺血管重塑有關［4］。

肺中含MC豐富，其分為兩類，一類是僅含類胰蛋白酶（Tryptase）的（TMC型），另一類是含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶（Chymase）的（TCMC型）。類胰蛋白酶可通過多種特性促進血管重塑：具有促進纖維化的生物學功能，通過肺成纖維細胞表面的蛋白酶活化受體（proteinase-activated receptor，PAR）-2的激活誘導肺成纖維細胞增殖，肺動脈平滑肌細胞、內皮細胞增生，肺血管壁Ⅰ型膠原的合成，最終導致肺血管壁的膠原纖維過量生成，膠原沉積［5］，從而導致肺動脈高壓。

本實驗中Ⅱ組相比Ⅰ組肺動脈管壁/管總面積比值增大（P＜0.05），管壁增厚，光鏡下肺動脈平滑肌細胞增生，超微結構觀察內皮細胞向管腔突起，基底縮窄，內彈力板明顯扭曲，血管外膜膠原大量密集，證明慢性低O2高CO2可以導致肺血管壁發生明顯改變。甲苯胺蘭染色實驗及透射電鏡觀察實驗結果顯示，Ⅰ組相比Ⅱ組肥大細胞胞膜穩定，減少脫顆粒現象。表明慢性低O2高CO2環境誘導肺小血管周圍肥大細胞增生，促進低氧性肺動脈高壓的形成，支持前述低氧下肥大細胞增生并促進肺動脈高壓形成的理論。

色甘酸鈉是常見的肥大細胞膜穩定劑，抑制肥大細胞裂解、脫顆粒。Banasova等發現，在慢性常壓低氧肺動脈高壓動物模型中早期預防性給予色甘酸鈉治療，可減輕肺血管重塑和低氧性肺動脈高壓的發生［6］。在肺動脈高壓相關動物模型中，早期給予色甘酸鈉治療，與非治療組相比，肺動脈管壁增厚減輕，血管平滑肌增生減少，血管壁/管腔比值降低，血管壁重塑被部分抑制。本實驗結果顯示，Ⅲ組相比Ⅱ組WA/TA比值降低（P＜0.05），光鏡下肺動脈平滑肌細胞不明顯增生，超微結構觀察內皮細胞、內彈力板等結構基本正常，血管外膜膠原未見明顯沉積，證明色甘酸鈉可以抑制慢性低O2高CO2性肺血管壁改變。甲苯胺蘭染色實驗及透射電鏡觀察實驗，Ⅱ組發生明顯脫顆粒現象，Ⅲ組相比Ⅱ組肥大細胞胞膜穩定，減少脫顆粒現象，因此肥大細胞膜脫顆粒參與慢性低O2高CO2性肺血管增生性改變的過程，色甘酸鈉可通過抑制肥大細胞活性而抑制慢性低O2高CO2導致的肺血管增生性改變。

［1］Hugh R.Tissue-specific expression of mast cell granule serine proteinases and their role in inflammation in the lung and gut［J］.Immunology，2002，105（4）：375-390.

［2］喻林升.慢性低O2高CO2大鼠肺肥大細胞對肺小動脈的作用［J］.中國應用生理學雜志，2000，16（3）：254-256.

［3］Pak O，Aldashev A，Welsh D，et al.Peacock A： The effects of hypoxia on the cells of the pulmonary vasculature［J］.Eur Respir J，2007，30（4）：364-372.

［4］Banasova A，Maxova H，Hampl V，et al.Prevention of mast cell degranulation by disodium cromoglycate attenuates the development of hypoxic pulmonary hypertension in rats exposed to chronic hypoxia［J］.Respiration，2008，76（2）：102-107.

［5］Frungieri M B，Weidinger S，Meineke V.Proliferative action of mast-cell tryptase is mediated by PAR2，COX2，prostaglandins，an d PPARγ： Possible relevance to human fibrotic disorders［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（23）：15072-15077.

［6］Banasov A，Maxov H，Hampl V，et a1.Prevention of mast cell degranulation by disodium cromoglycate attenuates the development of hypoxic pulmonary hypertension in rats exposed to chronic hypoxia［J］.Respiration，2008，76（1）：102-107.

R563

B

1671-8194（2015）11-0039-02

溫州市科技局科技計劃項目（Y20100185）；浙江省自然科學基金項目（Q13H150005）