鉤藤藥材中異鉤藤堿含量的超高效液相色譜和高效液相色譜法的測定

何紅暉

（長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021）

現代藥理學研究表明[1]，在鉤藤的莖枝中含有豐富的吲哚類生物堿，有效成分以鉤藤堿和異鉤藤堿為主，今次，對鉤藤中鉤藤堿以及異鉤藤堿進行含量測定具有很大的必要性。本次研究中出于建立異鉤藤堿高效液相色譜法的目的，分別采取超高液相色譜法和高效液相色譜法對鉤藤中異鉤藤堿含量展開了測定，現匯報結果如下。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器：試驗中需要用到的儀器包括：超聲波清洗儀（型號：KQ-250DB，廠家：昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（型號：Sartorius-BT124S/BT 25S電子天平，常見：北京賽多利斯儀器系統有限公司），高效液相色譜儀（Agilent 1100）等。

1.2 試劑與試藥：試驗所需試劑中乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。試驗中所需中藥材鉤藤樣品經鑒定為茜草科植物鉤藤的干燥鉤藤莖枝。異鉤藤堿購自上海中藥標準化研究中心，純度不低于98%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：高效液相色譜法所需色譜柱為Alltech C18柱，規格為4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相為乙腈-水，乙腈為流動相A，水為流動相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸調節pH值至7.5，梯度洗脫，0～20 min時A在50%～55%，流速為1.0 mL/min，檢測波長為246 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL；超高液相色譜法色譜柱為Waters ACQIITY UPLCTMT3 C18柱，規格為2.1 mm×50 mm，1.7 μL，流動相為乙腈-水，乙腈為流動相A，水為流動相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸調節pH值至8，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，檢測波長為246 nm，柱溫為50 ℃，進樣量為1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的制備：取鉤藤粉末樣品2 g，稱定后放置在圓底燒瓶中，精密加入2 mL氨水，悶潤30 min后，精密加入50 mL的乙腈，稱定重量后，加熱回流2 h，冷卻后再次稱重，經乙腈將損失重量補足，搖勻后過濾，取續濾液，作為供試品溶液。同法制成超過液相色譜法供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備：精密稱取異鉤藤堿對照品適量，經乙腈溶解后制成每毫升中含有異鉤藤堿50 g的對照品溶液，同法制成超高液相色譜法的對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察：超高液相色譜法：分別取食量的異鉤藤堿儲備液配制成濃度為0.4602、0.36816、0.27612、0.18408、0.09204、0.04602、0.02301、0.011505、0.002301和0.0004602 mg/mL的對照品溶液，在2.1所示色譜條件下1 μL進樣檢測，以對照品的濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標繪制標準去洗，結果得到異鉤藤堿的線性回歸方程為Y=4×106X-4364.9，r2=0.9999，證實異鉤藤堿濃度在0.4602～460.2 g/mL時存在良好的線性關系。

高效液相色譜法：精密稱取異鉤藤堿5.05mg，經乙腈溶解后配制成濃度為0.505 mg/mL的對照品溶液，精密吸取該溶液配制成不同濃度的對照品溶液，分別為：0.505、0.404、0.303、0.202、0.101、0.0505、0.02525、0.012625、0.002525、0.000505 mg/mL。在2.1所示色譜條件下20μL進樣檢測，記錄峰面積，以異鉤藤堿濃度為橫坐標，以峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線，結果得到異鉤藤堿的標準曲線為：Y=41.101X-0.233，r2=0.9999，證實異鉤藤堿濃度在0.505～505 g/mL之間時存在良好的線性關系。

2.3.2 精密度實驗：超高液相色譜法：選取濃度為0.036816 mg/mL的對照品溶液，一日日重復進樣3次，連續進樣3 d，按照2.1所示色譜條件1 μL進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD值為0.16%，證實該儀器的精密度良好。高效液相色譜法：選取濃度為0.02525 mg/mL的對照品溶液，日內重復進樣3次，連續3 d，在，2.1所示條件下20 μL進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD值為0.16%，證實該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩定性實驗：超高液相色譜法：精密稱定供試品2 g，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1所示色譜條件下分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h時1 μL進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD職位0.14%，證實溶液在72 h內的穩定性良好。

高效液相色譜法：精密稱定供試品2 g，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1所示色譜條件下分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h時1 μL進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD職位0.34%，證實溶液在72 h內的穩定性良好。

2.3.4 重復性實驗：超高液相色譜法：取6份鉤藤藥材粉末，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1色譜條件下進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD值為0.6%，證實該方法的重現性良好。高效液相色譜法：取6份鉤藤藥材粉末，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1色譜條件下進樣檢測，記錄峰面積，結果得到RSD值為1.5%，證實該方法的重現性良好。

2.3.5 回收率實驗：超高液相色譜法：取5份同一批次一直含量的鉤藤藥材樣品，分別精密加入一定量的對照品溶液，在2.1所示條件下進樣檢測，記錄峰面積，計算回收率，結果發現，平均回收率為96.41%，RSD值為3.1%；高效液相色譜法：取5份同一批次一直含量的鉤藤藥材樣品，分別精密加入一定量的對照品溶液，在2.1所示條件下進樣檢測，記錄峰面積，計算回收率，結果發現，平均回收率為98.01%，RSD值為4.1%。

2.4 樣品含量測定：取不同批次鉤藤藥材粉末樣品，在2.2.1條件下配制成供試品溶液，在2.1條件下進樣檢測，記錄峰面積，計算含量。結果發現，超高液相色譜法測定鉤藤中異鉤藤堿的含量平均為0.09653%，高效液相色譜法測定鉤藤中異鉤藤堿的含量平均為0.09159%，二者無明顯差異。

3 討 論

中藥材鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤的干燥帶鉤莖枝。鉤藤的主要功效為熄風定驚、清熱平肝，在肝風內動、感冒夾驚、驚癇抽搐、小兒驚啼、妊娠子癇以及頭痛眩暈等癥的治療中具有很好的效果[2]。經超高液相色譜法和高效液相色譜法對鉤藤中有效成分異鉤藤堿含量進行測定時具有方法準確可靠，操作簡單等優勢，值得關注。

[1] 張榮,劉睿,劉啟德,等.鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測定[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,11(4):1001-1003.

[2] 王曉穎,劉永靜,陳丹,等.HPLC法測定不同產地鉤藤中鉤藤堿的含量分析[J].中國中醫藥科技,2011,23(3):276-278.