兔魏氏梭菌的分離鑒定及藥敏試驗

王友良（山東省臨沂市蘭山區義堂畜牧獸醫站 276000）

兔魏氏梭菌的分離鑒定及藥敏試驗

王友良（山東省臨沂市蘭山區義堂畜牧獸醫站 276000）

魏氏梭菌病本病又稱產氣莢膜桿菌病是由A型魏氏梭菌產生外毒素引起的腸毒血癥，本病的發生無明顯季節性，除哺乳仔兔外，各種年齡、品種、性別的兔子均有易感性。以發病突然、急性腹瀉、排黑色水樣或帶血的膠凍樣、腥臭糞便、盲腸漿膜出血斑和胃粘膜出血、潰瘍為主要特征。發病率和死亡率均較高。

1 試驗材料與儀器

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

臨沂市蘭山區義堂鎮恒源養兔場發病死亡兔4只。

1.1.2 培養基及試劑

普通肉湯培養基（購自青島高科園海博技術有限公司）、瓊脂粉（購自天津市光復精細化工研究所）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（北京陸橋技術有限責任公司）、伊紅美藍瓊脂（中國獸醫藥品監察所北京中海生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂（中國獸醫藥品監察所北京中海生物科技有限公司）。

1.1.3 藥敏試驗紙片

藥敏試紙片（由臨沂大學獸醫預防醫學實驗室提供）。

1.1.4 試驗動物

10日齡雞胚6枚，2日齡雛雞6只，19～23g小白鼠6只，均由臨沂大學獸醫預防醫學實驗室提供。

1.2 試驗儀器

SW-WJ-LCU潔凈工作臺、酒精燈、接種環、鑷子、培養皿、生化培養箱、試管、試管架、高壓鍋、顯微鏡、玻片、革蘭氏染色液、藥敏片、生化管、錐形瓶、玻璃棒、電熱爐、手術剪、廢物缸，1ml注射器、厭氧培養缸、燒杯、量筒、250ml錐形瓶、300ml錐形瓶等。

2 試驗方法

2.1 臨床診斷

急劇腹瀉。患病兔最初的糞便變形、變軟，很快轉為帶血的膠凍樣、黑色或褐色稀糞，有惡臭腥味，肛門周圍、后肢及尾部被稀糞污染；被毛粗亂，精神不振，拒食，脫水，無體溫變化，最后消瘦死亡。剖開腹腔后有特異腥臭味，胃內充滿飼料，胃底粘膜脫落，可見大小不等的潰瘍。小腸充滿氣體，腸壁變薄，粘膜呈彌漫性出血。空腸和回腸內有大量的膠凍樣液體和氣體。盲腸和結腸內充滿氣體和黑綠色稀糞便，有腐敗臭味。大腸內充滿黑綠色稀糞，腥臭。肝臟稍腫、質地變脆，膽囊腫大、充滿膽汁，脾呈深褐色，膀胱積有茶色尿液，肺充血、瘀血，心臟表面血管怒張，呈樹枝狀。

2.2 病原菌分離鑒定

2.2.1 各種培養基的制備

2.2.1.1 普通肉湯培養基制備

取一定比例的普通肉湯培養基加熱溶于水中并不斷攪拌至煮沸，煮沸1min后裝于三角燒瓶，于高壓鍋滅菌后分裝于試管中。

2.2.1.2 斜面培養基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，用高壓鍋滅菌后，分裝于試管中，將試管斜放，凝固后制成斜面培養基。

2.2.1.3 普通瓊脂培養基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，分裝于平板中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.1.4 伊紅美藍培養基制備

2.2.1.5 麥康凱培養基制備

取一定比例的麥康凱瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，分裝于平板中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.1.6 血液瓊脂培養基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，用高壓鍋滅菌后冷卻至55℃左右，將適量兔血脫纖后加入其中混合均勻，分裝于平板中，冷卻待用。

2.2.1.7 半固體培養基制備

取適量瓊脂粉加熱溶于肉湯中至完全溶解，分裝于試管中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.2 涂片及染色

無菌操作用接種環在玻片上滴一滴生理鹽水，然后用滅菌接種環取病死兔的肝臟、腸粘膜或腸內容物與生理鹽水混合進行涂片，干燥、固定后進行革蘭氏染色，然后用油鏡進行觀察細菌形態及特點。然后將細菌接種于斜面培養基上，37℃培養24h后，無菌操作取培養的菌落進行涂片，干燥、固定后進行革蘭氏染色，用油鏡進行檢查。

但在后工業化時代里，“真實”“記憶”逐漸變成了沉重的話題。伯格繼續寫道，到20世紀后半葉，歷史的審判已被所有人遺忘，后期資本主義國家由于對過去的恐懼和對未來的盲目，喪失了可信仰的正義和真實原則轉而成為投機主義者。這種投機的心態使得所有的事物都蔚為奇觀，就像電影里的場面。相機變成一種工具，表演的場面造就出一種我們所期望的“永恒現在式”。換句話說，記憶和真實不再是不可或缺和讓人期待的。攝影為我們卸下了記憶和真實的負擔，它像上帝一樣監督著我們，同時也被我們所監督。[8]57

2.2.3 分離培養與觀察

無菌操作用接種環挑取斜面培養基上的菌落，分別在普通瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、麥康凱培養基、血液瓊脂培養基上進行分區劃線。在生化培養箱中37℃恒溫24h后，觀察單個典型菌落的形態特點。

2.2.4 運動性觀察

用滅菌的接種針取培養的純菌，在無菌環境下將接種針垂直刺入半固體培養基中，在生化培養箱中培養24h后觀察細菌運動情況。

2.2.5 生化試驗

用滅菌的接種針取培養的純菌，接種在生化管內，在生化培養箱中37℃恒溫培養24h后，觀察結果。

2.3 動物致病性試驗

2.3.1 雞胚接種

照蛋后畫出氣室及大血管的位置，酒精消毒后用大針在記號處鉆一小孔待用。用注射取24h肉湯培養的菌液0.3ml從小孔處注入雞胚尿囊腔中，用石蠟封孔后，將雞胚放入生化培養箱中繼續孵化，3d后觀察結果。

2.3.2 雛雞接種

將雛雞分為試驗組和對照組，每組3只。用注射器吸取24h肉湯培養的菌液0.5ml垂直注入試驗組雛雞腹腔，對照組雛雞腹腔注射0.5ml滅菌的生理鹽水，將雛雞繼續飼養觀察。

2.3.3 小白鼠接種

將小白鼠分為試驗組和對照組，每組3只。用注射器吸取24h肉湯培養的菌液0.5ml垂直注入試驗組雛雞腹腔，對照組雛雞腹腔注射0.5ml滅菌的生理鹽水，將雛雞繼續飼養觀察。

2.4 藥敏試驗

無菌操作用滅菌接種環取純培養物在盛有滅菌生理鹽水的試管中混勻，將菌液倒入普通瓊脂培養基中，晃勻后將菌液倒出。然后用滅菌的鑷子分別夾取不同的藥敏片放在培養基上（注意藥敏片之間距離相等并保持一定的距離），然后將培養基放在生化培養箱中37℃恒溫培養24h后，觀察結果。

3 試驗結果及分析

3.1 臨床診斷結果

根據臨床癥狀和病理剖檢變可初步確診該兔病由魏氏梭菌感染引起。

3.2 涂片染色結果

革蘭氏染色后，油鏡觀察為革蘭氏陽性的梭狀桿菌，菌體較大，單個存在或多個成簇存在，有的形成圓形或橢圓形的芽孢，位于中央或近端，呈梭狀，符合魏氏梭菌的形態特征。

3.3 分離培養結果

培養菌在肉湯中形成明顯渾濁，試管底部有云霧狀渾濁；在普通營養瓊脂培養基上生長良好，形成乳白色光滑圓形菌落；在伊紅美蘭瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基不生長；在血液瓊脂平板上有灰白色、邊緣不整似鋸齒樣、表面光滑隆起、直徑約2～4mm的菌落，周圍有明顯的溶血環。符合魏氏梭菌的生長特性。

3.4 運動性觀察結果

該菌在生化培養箱中培養24h后觀察細菌沿穿刺線生長，說明該菌無鞭毛生長，符合魏氏梭菌的生長特征。

3.5 生化試驗結果

本菌在厭氧條件下能分解乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，產酸產氣，不能發酵甘露醇。符合魏氏梭菌的生化試驗特性。

3.6 雞胚接種結果

經尿囊腔接種雞胚死亡，剖檢雞胚腸道有出血變化。無菌操作用接種環在雞胚的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。

3.7 雛雞接種結果

試驗組雛雞腹腔接種12～24h死亡。死雛出現了急劇下痢，并混有血液，剖檢主要病理變化與自然感染的病例相似，腸道出血且肝臟腫大土黃色。無菌操作用接種環在死雛的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。對照組雛雞正常。

3.8 小白鼠接種結果

試驗組小白鼠腹腔接種12～24h死亡。死亡小白鼠出現了出血性下痢，剖檢主要病理變化為腸道充滿氣體高度腫脹。無菌操作用接種環在死亡小白鼠的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。對照組小白鼠正常。

3.9 藥敏試驗結果

分離菌株對氟苯尼考、頭孢菌素、慶大霉素等高度敏感，對紅霉素、新霉素、阿莫西林中度敏感，對青霉素、卡那霉素、土霉素、四環素、復方新諾明產生了耐藥。

4 討論

（1）通過臨床診斷、病理剖檢及實驗室診斷確定該分離菌株為魏氏梭菌，并進行了藥敏試驗，找出了對本菌的有效藥物，能夠及時防治疾病。

（2）通過對小白鼠、雞胚和雛雞的接種，可以判斷該分離菌株為致病菌。

（3）通過對細菌來源及生活環境的調查，得出該菌存在廣泛，對兔的感染主要是通過腐敗的食物而傳染，以及臟亂等含菌較多的環境，因此在日常養殖中，要做到飼喂安全營養的飼料并保持好環境衛生，防止細菌的傳染傳播。

（4）正確的飼養可減少本病的發生；采用較低能量、較高纖維素的日糧可明顯減少腹瀉死亡率。一旦發現病兔或疑似病兔，應立即隔離或淘汰。預防方法可用魏氏梭菌氫氧化鋁滅活菌苗，每只兔皮下注射2ml，7d后開始產生免疫力，免疫期4～6個月。

（5）本病常規治療，可內服土霉素、四環素，均有一定的療效。但本次藥物敏感性試驗該分離菌對氟苯尼考、頭孢菌素、慶大霉素高度敏感，兔在應用氟苯尼考、頭孢菌素治療時應嚴格掌握劑量，否則極易引起中毒，應慎用。另外可用高免血清治療本病效果也較好。其方法是發現患病兔瀉痢后，視病兔大小，每只皮下注射高免血清5～10ml，每天1次，連用2～3d即可康復。