耐藥性癲癇患者血漿miRNA分子標志物的初步篩選*

陳 希，張 嘉，趙鐳，李丹露，胡寶榮

（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥學部，黑龍江 哈爾濱 150001）

耐藥性癲癇患者血漿miRNA分子標志物的初步篩選*

（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥學部，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的 分析耐藥性癲癇患者血漿miRNA表達譜，探討其變化對診斷耐藥性癲癇的價值。方法 利用miRNA芯片技術篩選耐藥性癲癇患者（耐藥組）、非耐藥癲癇患者（控制組）及健康人（對照組）各15例血漿的miRNA表達譜，并分析差異miRNA的生物學功能。結果 耐藥組患者血漿與對照組相比，篩選出12個差異表達miRNA，其中7個上調，5個下調；控制組患者血漿與對照組相比，篩選出12個差異表達miRNA，其中6個上調，6個下調；耐藥組與控制組相比，篩選出8個差異表達miRNA，其中5個上調，3個下調。結論 通過miRNA芯片技術發現了多個差異表達的miRNA，為探討耐藥性癲癇發病機制及尋找診斷依據提供了參考。

耐藥性癲癇；血漿；miRNA；分子標志物

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中長度約21～25個堿基的非編碼小RNA，作為遺傳中心法則的重要補充，約占人類基因組的1%，參與基因表達調控，能在不改變轉錄水平的同時，通過基因沉默對翻譯造成抑制作用，繼而對生物體的生長、發育產生極為重要的效應［1］。特定的miRNA表達譜能為疾病的診斷提供新型診斷指標。癲癇是一種由多種病因導致的腦部神經元高度同步化異常放電的臨床綜合征，病因復雜，病理改變多樣，其中以苔蘚纖維出芽作為主要的病理表現，能導致局部異常神經環路，造成癲癇發病［2］。約有30%的患者對抗癲癇藥物具有耐藥性，癲癇的耐藥性作用機理不明確，其死亡率較一般癲癇患者高4～7倍［3］。隨著高通量技術的廣泛應用，對耐藥性癲癇患者血漿采用miRNA微陣列芯片篩選出差異性表達的miRNA，可以確定一個到幾個耐藥性癲癇早期診斷的分子標志物，為耐藥性癲癇患者的早期診斷、病情監測和預后提供試驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取研究對象45例，年齡14～35歲，平均（25.17±7.62）歲；男26例，女19例。其中，以健康志愿者15例作為對照組，均為無中樞神經系統疾病史和家族史的志愿者，并簽署知情同意書。30例癲癇患者中，15例耐藥性癲癇患者作為耐藥組，抗癲癇藥物血藥濃度達到正常范圍值，且符合以下條件：癲癇發病類型符合國際抗癲癇聯盟1981年癲癇發作分類標準；規則服用丙戊酸、苯妥英鈉、馬西平、苯巴比妥等一線抗癲癇藥物2年或2年以上，癲癇發生頻率無顯著改善；手術中皮層腦電圖能明確記錄到癇樣放電；排除顱內占位性病變及其他神經系統疾病患者。另15例非耐藥性癲癇患者作為控制組，抗癲癇藥物血藥濃度達到正常范圍值，規則服用丙戊酸、苯妥英鈉、馬西平、苯巴比妥等一線抗癲癇藥物2年或2年以上，癲癇發生頻率明顯減少至原來的50%以下，病情得到明顯控制。本研究經醫院倫理委員會批準，采集參與對象空腹靜脈血5 mL于抗凝管中，冷凍保存備用。

1.2 儀器與試劑

miRNA Complete Labeling ang Hyb Kit，Affymetrix miRNA Microarray，Gene Expression Wash Buffer Kit均購自Affymetrix公司；mirVana RNA Isolation Kit購自Ambion公司；RNase－Free Dnase Set（50），miScript Reverse Transcription Kit，Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix均購自Qiagen公司。梯度PCR儀（Bio－Rad）；GeneChip Scanner 3000芯片掃描儀，低溫高速離心機（Beckman公司）。

1.3 方法

血漿RNA抽提：取400 μL血漿，使用mirVanaTM RNA Isolation試劑盒抽提總RNA，依照試劑盒說明書操作，采用分光光度計測定所提取RNA的質量。

加poly－A尾巴與熒光標記連接：將1 μg RNA，7 μL DEPC水，2 μL RNA Spike Control Oligospoly，5 μL ATP濃度為1 mmol／L Tris的溶液混合后快速離心。向上述溶液加入1.5 μL 25 mmol／L MnCl2，1.5 μL 10×reaction buffer，1.0 μL酸性磷酸酶，1.0 μL diluted ATP Mix后37℃孵育15 min；熒光標記連接，取上述混合物15 μL快速離心后置冰浴上，加入2 μL T4DNA連接酶，4 μL 5× FlashTag連接Mix生物素，混勻后快速離心，25℃孵育0.5 h。

芯片雜交：采用Affymetrix公司miRNA芯片試劑盒，遵從試劑盒說明書進行操作。雜交液的配制，50 μL 2×雜交Mix，5 μL 20×雜交對照物，5 μL去離子甲酰胺，10 μL DEPC水，1.7 μL對照物寡聚核苷酸B2及10 μL二甲基亞砜。將上述雜交液與生物素樣本混合后99℃孵育5 min，45℃孵育5 min，取100 μL用于微陣列雜交，48℃，60 r／min孵育16 h。

數據獲得：顯色后用GeneChip Scanner 3000芯片掃描儀掃描，提取數據。應用SAM軟件進行數據分析，初步篩選耐藥性癲癇患者血漿中，與控制組和對照組相比有差異性表達的miRNA。

miR－146a表達驗證：按照qPCR逆轉錄試劑盒說明書，20 μL反應體系，37℃孵育60 min，95℃溫育5 min終止反應，逆轉錄成cDNA后－20℃儲存備用。遵照qPCR試劑盒說明書，20 μL反應體系，95℃預變性2 min，40個循環，反應條件為95℃，15 s及60℃，60 s。通過ABI 7500定量PCR儀獲得Ct值，單個反應重復2次。

2 結果

2.1 3組的miRNA差異分析

通過對各組血漿miRNA芯片結果的分析顯示，與對照組相比，耐藥組有7個miRNA表達上調，分別為miR－207，miR－877，miR－146a，miR－467，miR－511，miR－451，miR－146a－5p；5個表達下調，分別為miR－150，miR－193，miR－122，miR－32，miR－222－3p。控制組中有6個表達上調，分別為miR－133b，miR－299，miR－450b－5p，miR－547，miR－574－3p，miR－511；6個表達下調，分別為miR－124，miR－590－3p，miR－32，miR－219，miR－200a，miR－551b。

2.2 控制組與耐藥組的miRNA差異分析

通過對耐藥組和控制組血漿miRNA芯片結果的分析顯示，與控制組相比，耐藥組血漿miRNA中有5個表達上調，分別為miR－486－3p，miR－502－3p，miR－98－5p，miR－93－5p，miR－222－3p；3個表達下調，分別為 miR－181a－3p，miR－137，miR－582－3p。

2.3 miR－146a表達qPCR驗證

對各組患者血漿中miR－146a進行qPCR驗證，結果顯示，耐藥組中表達量為（3.16±0.67）×2－△Ct，顯著高于控制組的（1.57±0.36）×2－△Ct和對照組的（0.79±0.55）×2－△Ct，差異顯著（t＝8.09，t＝4.59，P＜0.05）。

3 討論

隨著治療癲癇的新型藥物不斷問世，癲癇的治療效果有了顯著提高，但有的患者對抗癲癇藥物不敏感，治療效果仍不理想［4］。這類耐藥性癲癇患者在給予常規一線抗癲癇藥物治療后，雖其血藥濃度及耐受最大劑量達到了有效范圍值，但癲癇仍時常發作［5］。研究發現，在對一種抗癲癇藥物有耐藥的患者，給予其他作用機制不同的抗癲癇藥物治療，絕大多數患者仍表現出耐藥性，僅有不到10%患者的病情得到了有效控制［6］，臨床上成為多藥耐藥，即一種藥物導致的耐藥性，對其他作用機制不同的藥物也產生耐藥性。由此可見，耐藥性癲癇患者多表現出的耐藥性極有可能存在一種非特異性、共同的耐藥機制，使癲癇患者腦組織中癲癇灶部位抗癲癇藥物的濃度處于較低水平，從而導致療效差或耐藥性，但與該類的作用位點關系很小［7］。分子生物學技術的發展，便可從多種組織學技術角度去探究耐藥性癲癇的發病機制，這成為當今攻克癲癇病因的重要研究課題。

研究認為，P－糖蛋白（P－gp）可能參與了癲癇耐藥的機制。國內外的相關研究也已證實，很多AEDs均為上述耐藥蛋白的底物，而且P－gp在難治性癲癇患者腦組織和血漿中呈高表達［8］。已有研究表明，miR－27a與miR－451可在腫瘤細胞中調節P－gp的表達［9］。另外，應用Targetscan microRNA靶點預測網站，發現也有很多miRNA可以靶向P－gp，如miR－1，miR－137等。

本研究通過miRNA芯片獲得耐藥性癲癇患者、控制性癲癇患者和非癲癇者血漿miRNA表達譜，通過比較分析，發現了多個差異miRNA。通過對各組血漿miRNA芯片結果進行分析，結果顯示，耐藥組與對照組相比，有7個miRNA表達上調，有5個miRNA表達下調；控制組中有6個miRNA表達上調，有6個miRNA下調；與控制組相比，耐藥組血漿有5個miRNA表達上調，有3個miRNA下調。miR－124是大腦較豐富表達的一類miRNA，參與神經元的發育及分化，調節突觸的可塑性［10－11］。miR－124在癲癇異常神經網絡中調節神經再生及突出生長，通過抑制cAMP反應元件結合蛋白的表達，而后者所參與激活的下游基因可能參與了癲癇的發作過程［12］。Manna等［13］的研究結果顯示，miR－146a在星形膠質細胞激活區大量表達，由于癲癇發作而導致其細胞激活區高度表達miR－146a，提示其可能涉及顳葉癲癇發生中膠質細胞介導的炎性反應。

總之，本研究中針對耐藥性癲癇患者、非耐藥性患者及健康者的血漿miRNA譜進行分析，尋找耐藥癲癇患者血漿miRNA分子標志物，發現了多個差異表達的miRNA，為深入探討耐藥性癲癇發病機制及尋找診斷依據提供了參考。

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Preliminary Screening of Pasma miRNA Molecules Markers in Patients with Drug-Resistant Epilepsy

Chen Xi，Zhang Jia，Zhao Yilei，Li Danlu，Hu Baorong
（Department of Pharmacy，First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin，Heilongjiang，China 150001）

ObjectiveTo analyze the plasma miRNA expression profiling in the patients with drug-resistant epilepsy and investigate the value of the miRNA expression profiling change in diagnosing drug-resistant epilepsy.MethodsThe miRNA microarray technique was adopted to screen the plasma miRNA expression profiling in the patients with drug-resistant epilepsy，patients with non-drug-resistant epilepsy and healthy people.The biological function of difference miRNA was analyzed.ResultsCompared with the control group，12 differentially expressed miRNA in the drug-resistant epilepsy group were screened out，in which 7 miRNA were up-regulated，5 miRNA were down-regulated；compared with the control group，12 differentially expressed miRNA in the epilepsy control group were screened out，in which 6 miRNA were up-regulated and 6 miRNA were down-regulated；compared with the epilepsy control group，8 differentially expressed miRNA in the drug-resistantgroup were screened out，in which 5 miRNA were up-regulated and 3 miRNA were down-regulated.ConclusionMultiple differentially expressed miRNA are discovered by the miRNA microarray technique，which provides reference for further researching the pathogenesis of drug-resistant epilepsy and seeking the diagnosis basis.

drug-resistant epilepsy；plasma；miRNA；molecules markers

R446.1；R749.1＋7；R966

A

1006－4931（2015）02－0019－02

2014－05－12）

*哈爾濱醫科大學附屬第一醫院基金資助項目，項目編號：2013Y05。