microRNAs與Toll樣受體及缺血性腦卒中的關(guān)系研究進展

譚阿蕊 綜述 韓劍虹 審校

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 昆明 650101

缺血性腦卒中發(fā)病率高，病死率高，致殘率高。目前，臨床上治療缺血性腦卒中的主要手段是溶栓［1］，但由于存在治療時間窗限制，不適用于所有患者。因此，找到新的治療靶點顯得十分重要。腦缺血性損傷的病理生理機制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、凋亡基因激活、炎癥應(yīng)答等，其中Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷的病理過程中起重要作用。本文就缺血后Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其與microRNAs的關(guān)系研究進展進行綜述，旨在為尋找新的有效的治療靶點提供新思路。

1 microRNAs

microRNAs（miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長19～23個核苷酸序列的高度保守的非編碼小RNA，通過與特定的mRNAs完全或者部分互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平引起mRNAs的降解或者翻譯抑制［2］，涉及多種生物學(xué)過程，包括發(fā)育、分化、固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答等［3］。

miRNAs轉(zhuǎn)錄自外顯子與內(nèi)含子之間或基因組的其他基因間區(qū)基因，首先由細胞核中DNA 轉(zhuǎn)錄成長度大約為1 kb的初級miRNAs（pri－miRNAs），然后在細胞核內(nèi)經(jīng)核糖核酸酶Drosha和DGCR8／Pasha蛋白剪切成60～110bp大小，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，稱為前體miRNAs（pre－miRNAs），前體miRNAs在核膜轉(zhuǎn)運體exportin－5協(xié)助下從細胞核中轉(zhuǎn)運到胞漿中，經(jīng)另一種核糖核酸酶Dicer剪切生成長20～25bp的不完全雙鏈RNA，包括成熟miRNAs和其互補鏈。雙鏈在解旋酶的作用下解開，參與形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）［4］。miRNAs引導(dǎo)RISC 與目標mRNAs的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 的降解或翻譯抑制［5］。每一個高度保守的哺乳動物miRNA 可能和數(shù)百個不同的mRNA 靶向結(jié)合，因此幾乎所有的mRNA 都在某種程度上受miRNA 調(diào)控［6］。miRNAs的靶mRNAs可以通過測序的方法進行預(yù)測，但是由于存在假陽性和假陰性可能，因此預(yù)測后的結(jié)果必須通過實驗驗證。目前已發(fā)現(xiàn)人類腦組織表達數(shù)百種miRNA［7］，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理生理過程。

2 TLRs的特點及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）是一種膜識別受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，包括位于細胞外的富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)和位于細胞內(nèi)的Toll／IL－1受體同源區(qū)，即TIR 區(qū)，胞外的富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)能與配體特異性結(jié)合，胞內(nèi)的TIR區(qū)則負責(zé)接頭蛋白的募集，最終細胞激活生成大量炎性介質(zhì)，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前，已發(fā)現(xiàn)哺乳動物TLRs家族有13 個成員（人類11 個，鼠13 個），其中，TLR2和TLR4介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷病理過程中的免疫炎癥反應(yīng)［8］。TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MyD88依賴和MyD88非依賴兩條信號通路。TLRs通過MyD88募集活化下游IRK1、IRK2、IRK4和TRAF6，導(dǎo)致MAPK、IRF5激活，最終激活NF－κB通路導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子轉(zhuǎn)錄、釋放，即經(jīng)典的MyD88依賴信號通路；MyD88非依賴信號通路不需要MyD88的介導(dǎo)，直接或間接通過Mal蛋白、TRAM 或TRIF等接頭蛋白募集TRADD、TRAF3、TRAF6，進而激活下游炎癥因子表達［9］。

3 TLR2／TLR4與腦缺血

炎癥反應(yīng)在腦缺血性損傷過程中起重要作用，腦缺血早期在缺血半暗帶周圍小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞聚集，產(chǎn)生大量促炎癥因子，損傷神經(jīng)元、少突細胞、細胞外基質(zhì)，加重腦缺血性損傷［10］。動物實驗表明［11］，短暫性大腦中動脈閉塞導(dǎo)致梗死腦組織嗜中性粒細胞浸潤，24h 達 高 峰；炎 癥 相 關(guān) 分 子TLR2、TLR4、NF－κB、COX2、TNF－α顯著增加，特別是缺血后12～24h，表明TLR2／4信號通路可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重缺血性腦損傷。

TLR2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達于小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞，主要通過MyD88依賴途徑傳遞胞外信號，激活細胞分泌炎癥因子、促炎癥因子和促凋亡因子。大鼠局部腦缺血再灌注模型和體外再灌注模型均顯示TLR2 激 活 導(dǎo) 致IL－23 產(chǎn) 生 和 小 膠 質(zhì) 細 胞 分 泌IL－17，TLR2、IL－23、IL17三者形成一個信號軸，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加［12］。比較大腦中動脈閉塞1h，再灌注2d的TLR2缺乏小鼠和野生型小鼠發(fā)現(xiàn)，TLR2缺乏小鼠腦梗死面積更小［13］，與Lehnardt等［14］研究結(jié)論一致。類似地，使用TLR2抑制劑活體阻斷TLR2可減少實驗性腦卒中小鼠腦組織白細胞和小膠質(zhì)細胞浸潤和神經(jīng)元死亡［15］。另外，研究表明［16］，CD36缺乏小鼠短暫大腦中動脈閉塞并不誘導(dǎo)炎癥因子表達，表明腦組織中清道夫受體CD36為TLR2信號通路促發(fā)的炎癥反應(yīng)所必須。因此，TLR2－CD36復(fù)合體是腦缺血后炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)點。

腦TLR2表達在嚙齒動物短暫和永久性局部腦缺血模型和體外缺血模型中均增加。TLR2上調(diào)和TLR2信號通路通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重缺血性腦損傷。然而，關(guān)于TLR2在缺血性腦損傷中的作用有爭議性報道。Hua等［12］發(fā)現(xiàn)，小鼠急性局部腦缺血再灌注后，與野生型小鼠相比，TLR2KO小鼠病死率更高，神經(jīng)功能缺失更多，腦梗死面積更大，TLR2似乎通過增加保護性信號激活在腦缺血再灌注中起保護作用；使用TLR2配體預(yù)處理小鼠24h能對腦缺血起到明 顯 的 保 護 作 用［17］。TLR2 激 動 劑Pam3CSK4 可 通 過TLR2－PI3K／Akt依賴途徑顯著減輕局部腦缺血性損傷［18］。實驗結(jié)果不一致可能是由于實驗動物模型、動物體質(zhì)量、用于動脈閉塞的線栓直徑及涂層、缺血再灌注時不一致所致。

TLR4是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第1個TLR，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4主要表達于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，特別是小膠質(zhì)細胞。除MyD88 依賴途徑和非依賴途徑，TLR4 還通過MAPKs信號通路途徑介導(dǎo)細胞增殖、分化和凋亡。動物模型研究顯示［12］，TLR4KO 小鼠在急性腦缺血再灌注后梗死面積更小，神經(jīng)功能缺失減少，表明TLR4在腦缺血再灌注損傷病理過程中加劇腦損傷。短暫性腦缺血小鼠模型腦小膠質(zhì)細胞TLR4表達也上調(diào)。對不同種屬TLR4KO 小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)［8］：（1）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠梗死面積顯著減小，神經(jīng)功能評分提高，而TLR3，TLR9KO 小鼠不會改變；（2）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠缺血區(qū)域CD11b陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)減少，NF－κB 激活減少；（3）TLR4缺乏小鼠腦炎癥和損傷相關(guān)介質(zhì)表達更少，包括IRF1、IFNβ、iNOS、MMP－9、COX2，證實了TLR4可通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加劇腦損傷。

4 TLRs與miRNAs相互調(diào)控

TLRs信號通路的信號分子受許多機制調(diào)節(jié)，包括物理相互作用、構(gòu)象改變、磷酸化、泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解［19］，但更為節(jié)能的方式是通過mRNA 降解或調(diào)節(jié)TLR 信號分子的表達。隱孢子蟲感染通過MyD88／NF－kB 依賴的方式減少miRNA－let－7的表達，同時增加TLR4 的表達，過表 達miRNA－let－7 顯 著 增 加TLR4 蛋 白 的 表 達［20］，表 明miRNA－let－7對TLR4存在調(diào)控作用。已證實，miRNAs能在多個水平調(diào)控TLR 信號通路，包括：（1）調(diào)控TLRs表達，如TLR4表達受miR－223、let－7i、let－7e的調(diào)控，TLR2表達受miR－105調(diào)控；（2）作用于通路信號分子，如miR－155作用于MYD88，miR－146作用于IRAK1、IRAK2、TRAF6等；（3）作用于轉(zhuǎn)錄因子，如miR－9作用于NF－κB1等；（4）作用于細胞因子mRNAs，如let－7作用于IL－6 mRNA、miR－155作用于TNF mRNA 等；（5）作用于TLR 信號通路調(diào)節(jié)劑相關(guān)基因，如miR－132調(diào)控ACHE編碼基因等［21］。

實驗發(fā)現(xiàn)，給予TLR4配體LPS，可增加單核細胞miR－146a、miR－155 和miR－132 的 表 達［22］。然 而，TRAF6 和IRAK－1是miR－146的靶點，是TLR 介導(dǎo)的NF－kB激活的重要分子。表明miR－146可能是固有免疫和炎癥應(yīng)答TLR 通路中的負反饋調(diào)節(jié)分子。動物實驗證實，TLR4和TLR2激活巨噬細胞，上調(diào)miR－125a－5p，而TLR3 不行。MiR－125a－5p是巨噬細胞相關(guān)炎癥應(yīng)答的負性調(diào)節(jié)分子［23］。大量研究表明［21］，TLR4可上調(diào)miR－155、miR－146、miR－132、miR－21、miR－223、miR147、miR－9、miR－125b、let－7e、miR－27b，下 調(diào)miR－125b、let－7i、miR－98；TLR2 可 上 調(diào)miR－155、miR－146、miR－147、miR－9。

5 缺血性損傷中miRNA 與TLRs的調(diào)控關(guān)系

TLRs介導(dǎo)的過度免疫炎癥反應(yīng)在缺血再灌注引起的組織損傷中發(fā)揮重要作用，但其機制尚未完全明了。在小腸缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，IRAK1 聚集將引發(fā)小腸缺血再灌注引起的上皮免疫高反應(yīng)，而miR－146a可以控制IRAK1上調(diào)，阻止免疫高反應(yīng)［24］，說明miR－146a在小腸缺血再灌注中可通過TLR 信號通路減輕免疫炎癥反應(yīng)，減輕再灌注損傷。在肝臟缺血再灌注損傷研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，肝再灌注24h中肝miR－146a的表達下調(diào)，再灌注6h達最低。再灌注24h中TLR4，TRAF6，IRAK1 隨miR－146a的減少而增加，6h 達 高 峰，提 示 在 肝 再 灌 注 損 傷 中，miR－146a 與TLR4可能存在調(diào)控關(guān)系［25］。另外，在心肌缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)［26］，增加miR－146a表達可以減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制可能為通過抑制IRAK1 和TRAF6 而減少NF－kB激活和炎癥因子產(chǎn)生。此外，Santra等［27］通過細胞模型試驗證實，胸腺素β4可通過上調(diào)miR－146a促進少突膠質(zhì)細胞分化，抑制IRAK1和TRAF6表達，從而抑制TLR 促炎癥通路。

6 展望

神經(jīng)系統(tǒng)許多miRNA 表達具有時序性，表明其參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育、生理和疾病過程。現(xiàn)已有研究證實，miR－146a是星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)劑。據(jù)此我們可以推測，miR－146a可能也在腦缺血性損傷中通過TLR 信號通路影響炎癥因子表達。但目前miRNAs對炎癥反應(yīng)TLR 信號通路的調(diào)控在缺血性腦損傷研究中還未見報道。深入了解缺血性腦卒中病理過程中miRNAs的作用和靶點，有助于為缺血性腦卒中的預(yù)防、診斷和治療提供新的方法和靶點。目前，關(guān)于miRNAs在免疫炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機制和生物學(xué)功能已作了大量研究，但還未完全明了，其在缺血性腦卒中中的具體機制需要進一步研究闡明。miRNAs在缺血性腦卒中的治療上具有廣闊的前景，隨著miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)，更多的調(diào)控關(guān)系被證實，通過干預(yù)缺血性腦卒中病理過程不同環(huán)節(jié)的miRNAs表達以減輕腦損傷，對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

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