高效液相色譜—質譜聯用技術同時測定人體尿液中11種代謝物

王磊君+李鋼+鄭賽晶+費婷+劉鴻+戚大偉

摘 要 采用高效液相色譜-質譜聯用技術定量檢測人體尿樣中丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、苯乙烯、巴豆醛的巰基尿酸類代謝物及氰化氫代謝物。將解凍后的尿樣經高速離心后，取100 μL上清液，加入50 μL內標溶液及850 μL水后上樣分析。色譜分析采用XSELECT HSS T3 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm），以乙腈-15 mmol醋酸銨溶液梯度洗脫，流速250 μL/min，柱溫40 ℃，在多反應監測模式（MRM）下采用負離子掃描模式進行定量分析。本方法共檢測了16名吸煙者和6名非吸煙者的尿樣，發現日吸煙量大于25支的吸煙者尿樣中的煙氣成分代謝物濃度高于非吸煙者。

關鍵詞 高效液相色譜-質譜聯用技術; 尿液; 代謝物

1 引 言

卷煙燃燒會產生大量的揮發性有機化合物（VOCs），其中就包括丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、氰化氫、苯乙烯、巴豆醛等，這些揮發性有機物具有較強的致癌或致突變作用[1～3]，吸入后會對人體的代謝物產生影響。有些代謝物是吸入卷煙煙氣后由煙氣成分代謝產生的，稱為外源性代謝物;有些則是人體本來就存在的代謝物，只是因為吸煙導致其含量變化，稱為內源性代謝物。隨著吸煙與健康這一話題的日漸升溫，急需建立一種方便可靠的VOCs暴露量評價方法，直接針對代謝物進行分析。

目前， 通常采取檢測呼出氣體、血液及尿液中VOCs代謝物的含量評價VOCs的接觸水平。其中檢測尿樣中VOCs的代謝物對人體的侵入性低，且取樣方便，同時尿液中的代謝物相對于血液中母體化合物生物半衰期更長、更穩定，所以目前檢測尿液中的代謝物逐漸代替了其它評價方法。已有一些文獻報道測定這些有害氣體在尿液中的代謝物，包括苯的代謝物苯巰基尿酸（S-PMA）、1，3-丁二烯的代謝物 N-乙酰基-S-（3，4-二羥基丁基）-L-半胱氨酸（DHBMA）等[4～8]，主要是針對一些特定的職業環境進行的研究，只能評價個別VOCs的影響，而對于煙氣這種含有多種VOCs的復雜體系，同時測定多種VOCs代謝物的分析方法鮮有報道。本研究建立了同時測定11種代謝物的分析方法，評價煙氣中氰化氫、苯乙烯、巴豆醛、苯、1，3-丁二烯對于人體的接觸水平。本方法前處理簡單，適合高通量分析，特別適合煙氣中VOCs代謝物研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200液相色譜儀，配有G1329A自動進樣器、G1311A四元混合泵以及G1316A柱溫箱（美國安捷倫公司）;Eppendorf 5810R 高速離心機（德國Eppendorf公司）; API4000三重四級桿串聯質譜儀，配電噴霧離子源（ESI）和Analyst1.6軟件數據處理系統（美國應用生物系統公司）。乙腈、甲醇（質譜級，德國默克公司）;醋酸銨（色譜純，德國默克公司）;代謝物標樣及其內標（詳見表1），其中MHBMA-1和MHBMA-2為1∶1混合物，實驗結果以兩種物質的總量計（純度均>99%，加拿大多倫多化學試劑公司）;Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統（德國Merck Millipore 公司）。

2.2 標樣與尿樣樣品準備

用甲醇將各同位素內標配制成1 g/L的工作液。采用流動相將11種待測物的標準品配制成質量

2.3 液相色譜及質譜條件

液相色譜條件：色譜柱 XSELECT HSS T3 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm，美國Waters公司）; 流動相： A為15 mmol/L醋酸銨溶液，B為乙腈; 流速： 0.25 mL/min; 梯度洗脫程序： 0～2 min， 97% A; 2～4 min，97%～5% A; 4～10 min， 5%～10% A; 10～10.5 min， 10%～50% A; 10.5～12.5 min， 50% A; 12.5～13 min， 50%～3% A; 13～20 min， 3% A。

質譜條件： 電噴霧離子源（ESI），負離子掃描方式，多反應檢測（MRM）模式; 噴霧（IS）電壓為： Symbolm@@ 4500 V; 霧化氣（Gas1，氮氣）： 為344.5 kPa; 氣簾氣（Curtain Gas，氮氣）：壓力為： 206.7 kPa; 輔助霧化氣（Gas2，氮氣）壓力為310.0 kPa; 離子源溫度（TEM）為： 600 ℃。

2.4 數據分析

為研究吸煙組與非吸煙組尿液代謝物之間的相關性，依據卷煙抽吸量不同，采用兩樣本雙向t檢驗計算p值，來評估兩組間的統計學差異。當p<0.05時，認為統計學上有顯著差異。

3 結果與討論

3.1 分析條件的優化

采用針泵注射的方式掃描標準溶液并得到相應的多反應監測（MRM）離子對，并優化各質譜參數（見表2）。考察了Agilent Porshell SB、Waters XSELECT HSS T3、Waters XBridge等色譜柱，最后選擇了分離度更好的XSELECT HSS T3柱，在乙腈-醋酸銨水溶液流動相體系下，可以實現MHBMA的3種同分異構體的分離，11種目標物的分離效果見圖1。

3.2 質譜斷裂機理研究

研究表明，疏基尿酸類物質在負離子模式下易丟失m/z 129中性分子^[9]，這一特性可以證實疏基尿酸的存在。例如MHBMA主要以[M-H] Symbolm@@ 離子形式存在，圖2為MHBMA [M-H] Symbolm@@ 離子m/z 232的二級串聯質譜圖及其碎片離子示意圖。質譜數據表明，m/z 232離子在二級質譜中發生斷裂，生成主要特征離子為m/z 103。這個特征離子的產生有m/z 232離子及其半胱氨酸主鏈上鍵斷裂，失去m/z 129（C5H7O3N）而得。endprint

3.3 分析方法驗證

以11種代謝物與相應內標定量離子的峰面積比（Y）為縱坐標，質量濃度為橫坐標X（μg/L）進行回歸運算，得到相應的線性回歸方程。11種代謝物的相關系數在0.990～0.999之間，表明待測物有良好的線性關系。以信噪比（S/N）不低于3時的進樣濃度為檢測限（LOD），結果表明，本方法11種代謝物的檢測限在0.5～30 μg/L之間（表3），除MHBMA3與PMA外，檢出限均優于文獻值。

在經過處理的空白尿液樣本中添加低、中、高3種不同濃度的樣品，每個濃度6份樣品，分別計算回收率與相對標準偏差（RSD）。結果表明，方法平均回收率為89.8%～123.8%，RSD值在3.1%～14.4%之間（見表3）， 表明本方法結果準確，可以滿足定量要求。

3.4 吸煙和非吸煙者尿液樣本的測定

采用LC-MS/MS法測試了6名非吸煙者與16名吸煙者24 h尿液中11種代謝物的濃度。從表4可見，吸煙者尿液中幾種代謝物平均值如3HPMA、CEMA、HPMMA等的含量明顯高于非吸煙者，以CEMA為例，日吸煙量高于25支的樣本的平均濃度達142.8 ng/mL，與非吸煙組對照計算得p=0.05（圖3a），說明吸煙能顯著影響丙烯醛在尿液中的排出量。1，3-丁二烯的代謝物MHBMA1-3也表現出相同規律。另外一些巰基尿酸物質及氰化氫代謝物ATCA在吸煙者和非吸煙者尿液中含量差異不明顯。以ATCA〖為例（圖3b），日吸煙量高于25支的樣本的p=0.37，并無明顯相關性，可能是氫氰酸的代謝也可能來

自食品或者氨基酸的生物分解^[18]，吸煙者的整體平均值仍高于非吸煙者。同樣，苯的代謝物PMA與DHBMA也可能源于山梨酸，而這是一種食品中常見的防腐劑^[19]。一些代謝物的不相關性的問

題的主要原因可能是：①當地空氣質量對實驗結果產生明顯影響，有些揮發性有機物如氰化物和苯乙烯并非全部來自于煙氣，在食品和環境大氣中也廣泛存在;②不同受試者代謝能力及飲食習慣有所不同，這些揮發性有機物進入體內的途徑也更多，需要進一步研究。

4 結 論

建立了同時測定尿液中氰化氫、苯乙烯、巴豆醛、丙烯醛、苯、1，3丁二烯的相應11種代謝物ATCA， PHEMA， MA， HPMMA， CEMA， 3HPMA， PMA， MHBMA1-3和DHBMA的LC-MS/MS方法。該方法操作簡單選擇性好，靈敏度高，適合于分析吸煙者尿液中相關代謝物。通過實驗分析，可以發現吸煙者尿液中11種代謝物的平均水平高于非吸煙者，但不同樣本間差異性較大，這應該與個體的代謝能力、飲食習慣以及當地的空氣質量有較大關系，這些差異仍需要深入研究。

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Simultaneous Determination of 11 Volatile Organic Compounds

Metabolites in Human Urine Using High Performance Liquid

Chromatography Coupled with Electrospray

Ionization Tandem Mass Spectrometry

WANG Lei-Jun， LI Gang*， ZHENG Sai-Jing， FEI Ting， LIU Hong， QI Da-Wei

（Technical Center， Shanghai Tobacco Group， Shanghai 200082， China）

Abstract We developed and validated a method using high performance liquid chromatography （HPLC） coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry （ESI-MS/MS） to simultaneously quantify 11 urinary volatile organic compound （VOC） metabolites. The frozen urinary samples were unfrozen at room temperature and centrifuged to remove settled precipitate. 100 μL of the supernatant and 50 μL of internal standard were added and then diluted by 850 μL of water so as to be analyzed by LC-MS/MS. The compounds were separated on a XSELECT HSS T3 column using acetonitrile as mobile phase A and 15 mmol/L ammonium acetate as mobile phase B at a flow rate of 250 μL/min. The analytes were determined qualitatively and quantitatively under multi-reaction monitoring （MRM） and negative polarity mode. The limits of detection ranged from 0.5-30 μg/L and the spiked recoveries of the analytes ranged from 89.8%-123.8% with RSDs of 3.1%-14.4%. This method was applied to 22 h urine samples collected from 16 smokers and 6 non-smokers. The results showed that the contents of the metabolites in smoker′s urine were higher than those of nonsmokers， especially， smoking more than 25 cigarettes per day.

Keywords Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Urine; Metabolites

（Received 11 June 2014; accepted 12 September 2014）endprint