基于熒光素汞熒光法結(jié)合光纖傳感—微順序注射—閥上實(shí)驗(yàn)室測(cè)定腸灌流液中H2S

侯俊峰+關(guān)明+李新霞

摘 要 建立基于光纖傳感技術(shù)結(jié)合微順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室熒光猝滅測(cè)定腸灌流液中H2S含量方法。本研究進(jìn)行單因素考察，確定以100 μL 0.1mol/L NaOH溶液為載液，熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L、體積50 μL、進(jìn)樣體積50 μL、流通池檢測(cè)流速25 μL/s，根據(jù)H2S猝滅熒光素汞521 nm處熒光，對(duì)樣品中H2S濃度進(jìn)行測(cè)定。本方法檢測(cè)H2S的濃度范圍為5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L，檢出限為5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L。測(cè)定腸灌流液中H2S含量為3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L，RSD=3.1%（n=3）。本方法能有效在線測(cè)定樣品中H2S含量，為實(shí)時(shí)在線測(cè)定生物樣品中的H2S含量奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 光纖傳感 硫化氫 微順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室 熒光素汞 熒光猝滅

1 引 言

硫化氫（H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，是空氣和水源的污染物之一。近研究發(fā)現(xiàn)，H2S是繼NO和CO之后又一種新型信號(hào)分子，作為一種活性神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，參與并調(diào)節(jié)動(dòng)物體諸多的生理病理活動(dòng)[1]。目前，H2S的測(cè)定方法大多局限于傳統(tǒng)方法，如亞甲基藍(lán)法[2]、硝酸銀比色法[3]、氣相色譜法[4]等。這些傳統(tǒng)的方法檢出限和靈敏度無法滿足生物樣品中極微量甚至痕量H2S測(cè)定要求。而熒光法的靈敏度更高，測(cè)定H2S數(shù)量級(jí)達(dá)到10 Symbolm@@ 6 mol/L。熒光素汞具有很強(qiáng)熒光，H2S中S2 Symbolm@@ 與熒光素汞結(jié)合，使熒光素汞熒光猝滅，H2S含量與熒光素汞的熒光強(qiáng)度具有良好的相關(guān)性。

微順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室（MicroSIA Lab-on-valve，μSIA-LOV）是第三代流動(dòng)注射分析技術(shù)[5]，在μSIA-LOV分析系統(tǒng)中，所有的單元操作，如樣品稀釋、試劑試樣的加入、混合以及多種連用技術(shù)的結(jié)合，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定過程能夠可控、高效地進(jìn)行。該系統(tǒng)能將試劑及樣品消耗降低至微升水平，減少了試劑的使用量，適用于長時(shí)間監(jiān)測(cè)和試劑比較昂貴、樣品來源受限的分析。LOV系統(tǒng)不僅可以與光纖傳感結(jié)合，也可以靈活與電化學(xué)[6]、色譜[7]、化學(xué)發(fā)光[8]、固相萃取[9]、原子熒光[10]等方法聯(lián)用。

本研究將光纖傳感技術(shù)與微量順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室（μSIA-LOV）結(jié)合，以光纖作為傳導(dǎo)介質(zhì)，將光纖光譜儀、微順序注射分析儀八通閥和氙燈光源連接，用計(jì)算機(jī)控制，利用該系統(tǒng)自動(dòng)介觀流控特征與光纖傳感的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)相連，可以實(shí)現(xiàn)樣品的在線監(jiān)測(cè)。本研究以Na2S為供體，建立光纖傳感-微量順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)腸灌流液中H2S的分析方法，為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物在體腸灌流H2S或H2S供體藥物的腸吸收特性研究奠定分析基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

微量順序注射儀（美國FIAlab Instruments公司）;光纖光譜儀（QE65000-FL，CCD）、連續(xù)氙燈光源（HPX-2000）、200 μm×1 m光纖兩根均為美國Ocean optics公司產(chǎn)品。PB-10型pH計(jì)（德國Sartorius公司）;實(shí)驗(yàn)流路所用連接管道采用PTFE管（0.75 mm，I.D.）。分別采用安裝有FIAlab for Windows和SpectraSuite 軟件的Windows XP系統(tǒng)臺(tái)式電腦對(duì)微量順序注射分析儀和光纖光譜儀進(jìn)行控制。光纖傳感-微順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室儀器裝置：包含一個(gè)1000 μL高精密度注射泵、一個(gè)棕色濾光8通道的多位閥模塊（LOV），在該模塊上集成了一個(gè)中心控制通道、多個(gè)工作通道及一個(gè)多功能流通池等操作單元;通過軟件調(diào)節(jié)控制中心通道一端與8位閥上聯(lián)通位置，使中心通道與工作通道準(zhǔn)確連接，另一端與高精度注射泵相連而構(gòu)成流動(dòng)分析系統(tǒng)。一根光纖與光譜儀相連，另一根光纖與氙燈光源相連，兩根光纖探頭插入LOV流通池接口，光路垂直組成熒光測(cè)定模式。

2.2 試劑及溶液配制

熒光素汞（優(yōu)級(jí)純， 美國化學(xué)服務(wù)公司）;Na2S·9H2O（分析純， 天津市福晨化學(xué)試劑廠）;其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

準(zhǔn)確稱取0.0159 g熒光素汞，用0.1 mol/L NaOH定容到100 mL棕色容量瓶中，濃度為1.874×10 Symbolm@@ 4 mol/L，冷藏備用，使用時(shí)稀釋到所需濃度。準(zhǔn)確稱取0.240 g Na2S·9H2O，用水溶解并定容到100 mL，濃度為0.01 mol/L， 4 ℃密封保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)用水稀釋到所需濃度。

Kreb-Ringer′s（KR）營養(yǎng)液：準(zhǔn)確稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g于1000 mL容量瓶中，用水定容，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

系列濃度H2S腸灌流液的配制：將0.01 mol/L Na2S溶液用KR營養(yǎng)液稀釋10倍（1.0 mmol/L），再分別取稀釋液0， 0.05， 0.1， 0.15， 0.2和0.25 mL于5 mL容量瓶中，用KR營養(yǎng)液定容。

供試品溶液：由KR營養(yǎng)液配制的Na2S溶液（5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），健康大鼠麻醉后，將KR營養(yǎng)液由活體空腸灌流（蠕動(dòng)泵流速0.2 mL/min） 30 min，接取供試品溶液于5 mL EP管中，封口4 ℃保存，待測(cè)。

2.3 操作流程

實(shí)驗(yàn)流路如圖1所示，在注射泵的驅(qū)動(dòng)下，首先由多位閥的6號(hào)口吸入適量載液（0.1 mol/L NaOH），7號(hào)口以50 μL/s的速度先后從中心通道吸入50 μL熒光素汞溶液，再以50 μL/s由5號(hào)口吸入適量樣品溶液，endprint

再通過6號(hào)口以50 μL/s吸入100 μL載液。在注射泵的驅(qū)動(dòng)下，被吸入儲(chǔ)液線圈中的載液推動(dòng)試劑和樣品迅速混合，形成混合區(qū)帶，并充分反應(yīng)，然后再反向以25 μL/s的流速將混合區(qū)帶從連接有光纖的多功能流通池（Flow cell）流出，通過光纖光譜儀讀取反應(yīng)后溶液的熒光強(qiáng)度。每次測(cè)定結(jié)束后，用水以300 μL/s流速?zèng)_洗整個(gè)流路。所有實(shí)驗(yàn)操作均由FIAlab軟件自動(dòng)完成，上述程序操作分6步，見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光素汞熒光光譜

由通道5吸入200 μL熒光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L），得到光譜圖（圖2），結(jié)果表明，熒光素汞最大發(fā)射波長位于521 nm。

3.2 熒光素汞濃度的選擇及體積

考察熒光素汞濃度（1.0×10 Symbolm@@ 4 mol/L ， 1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， 1.0×10 Symbolm@@ 6 mol/L）的影響，由于LOV為封閉的管道系統(tǒng)，管徑很小，熒光素汞濃度過大， 會(huì)粘附在管道內(nèi)，清洗使用試劑多、時(shí)間長，影響測(cè)定效率;熒光素汞濃度過低， 會(huì)影響測(cè)定靈敏度，故本實(shí)驗(yàn)選擇熒光素汞的濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L。 溶液體積越大，混合程度越低，為了確保充分混合、反應(yīng)完全，本實(shí)驗(yàn)選擇熒光素汞溶液體積為50 μL。

3.3 載流NaOH溶液濃度及體積

根據(jù)文獻(xiàn) [11]，熒光素汞在堿性條件下熒光較強(qiáng)增加實(shí)驗(yàn)的靈敏度，本研究考察不同濃度的NaOH溶液（0.01， 0.05， 0.1， 0.2和0.5 mol/L）以及水作為載液對(duì)熒光素汞（1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L）與1.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L Na2S熒光強(qiáng)度的影響（圖3），綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol/L NaOH作為載液。NaOH溶液為整個(gè)體系提供堿性環(huán)境，沖洗管路并推動(dòng)反應(yīng)后，溶液全部流過流通池，本實(shí)驗(yàn)采用100 μL的0.1 mol/L NaOH作為載液，即達(dá)到上述目的。

3.4 流通池檢測(cè)流速

0.1 mol/L NaOH溶液中熒光素汞與1.0×10 Symbolm@@ 5mol/L Na2S反應(yīng)后，考察通過流通池流速分別為10， 15， 20， 25， 30， 35和40 μL/s時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果表明，流速過慢，會(huì)加大對(duì)供試品的稀釋效應(yīng);流速過快，信號(hào)穩(wěn)定，重現(xiàn)性降低。在流速為25 μL/s時(shí)，檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)且穩(wěn)定（圖4）。

3.5 干擾物質(zhì)測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，含巰基氨基酸可能是內(nèi)源性H2S的供體，故本實(shí)驗(yàn)在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以5%的最大允許誤差進(jìn)行干擾測(cè)定，考察了L-半胱氨酸、蒜氨酸、高半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及大蒜辣素對(duì)H2S測(cè)定造成的干擾，結(jié)果如表2所示。

3.6 性能分析

熒光素汞濃度為5.0×10 Symbolm@@ 5mol/L， 0.1 mol/L NaOH溶液為載液，檢測(cè)流速為25 μL/s，檢測(cè)波長為521 nm，供試品進(jìn)樣量50 μL，測(cè)定系列濃度硫化氫腸灌流液，獲得在521 nm處的熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度與濃度進(jìn)行線性回歸，在5.0×10 Symbolm@@ 6～8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L范圍內(nèi)，線性方程為y= Symbolm@@ 262.13x+26182（圖5），相關(guān)系數(shù)r=0.997。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將微量順序注射-閥上實(shí)驗(yàn)室（μSIA-LOV）系統(tǒng)與光纖傳感技術(shù)結(jié)合，建立了熒光素汞二元體系熒光猝滅法測(cè)定生物樣品中H2S含量的方法。H2S作為一種信號(hào)分子，本身是內(nèi)源性物質(zhì)，參與和調(diào)節(jié)動(dòng)物體多種生理及病理活動(dòng)，目前對(duì)H2S的測(cè)定方法大多采用需取樣分析，需要經(jīng)過多步樣品前處理。本實(shí)驗(yàn)則是在LOV模塊上以熒光測(cè)定模式進(jìn)行樣品測(cè)定，簡化了操作步驟，每一步操作采用程序化控制，提高了實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和規(guī)范性;整個(gè)系統(tǒng)微升級(jí)的進(jìn)樣量大大降低了試劑和樣品的消耗，顯著提高分析速度。本方法與光纖傳感相連可實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)H2S的在線監(jiān)測(cè)。

References

1 Kimura H. Amino Acids， ?2011， 41（1）： 113-121

2 ZHAO Jing， FANG Li-Ping， XU Ge-Yang， TANG Chao-Shu. GENG Bin. Journal of Peking University： Medical Sciences， 2008， ?39（5）： 449-452

趙 晶， 房立平， 許戈陽， 唐朝樞， 耿 彬. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2008， ?39（5）： 449-452

3 XIA Wei-Wen， DUAN Ni. Chinese Journal of Health Inspection， ?2010， ?20（10）： 2618-2618

夏衛(wèi)文， 段 妮. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2010， ?20（10）： 2618-2618

4 Zheivot V I， Krivoruchko V N， Medvedev A S， Voroshina O V. Anal. Chem.， ?2006， ? 61（4）： 334-337

5 Wang J H， Hansen E H. Trends in Analytical Chemistry， ?2003， ?22（4）： 225-231endprint

6 Wang Y， Wang L， Tian T， Yao G，Hu X，Yang C，Xu Q. Talanta， ?2012， ? 99（15）： 840-845

7 Vichapong J， Burakham R， Srijaranai S， Grudpan K. Journal of Separation Science， ?2011， ? 34（13）： 1574-1581

8 WANG Yang， FAN Shi-Hua. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2005， ?25（2）： 184-187

王 洋， 范世華. 光譜學(xué)與光譜分析，2005， 25（2）： 184-187

9 Vidigal S S M P， Tóth I V， Rangel A O S S. Analytical Methods， ?2013， ? 5（3）： 585-597

10 Rodríguez R， Avivar J， Ferrer L， Leal L O， Cerda V. Talanta， ?2012， ? 96： 96-101

11 Hunt A L， Alder J F. Anal. Chim. Acta， ?1999， ? 387（2）： 207-215

12 Li L， Rose P， Moore P K. Annual Review of Pharmacology and Toxicology， ?2011， ? 51： 169-187

Fluorescein Mercury Combined with Optical Sensing Micro

Sequential Injection Lab-on-Valve for Determination of

H2S in Intestinal Perfusate

HOU Jun-Feng1， GUAN-Ming1， LI Xin-Xia*2

1（Laboratory on Pollution Monitoring and Control， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

2（College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract A fluorescence quenching method was established for the determination of H2S in intestinal perfusate by optical fiber sensing technology combined with micro sequential injection lab-on-valve （μSIA-lov）. In the experiment， 100 μL of 0.1 mol/L NaOH was used as the carrier， and 50 μL of 5.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L fluorescein mercury and 50 μL of sample were selected for the determination. The detection flow rate at the flowcell was 25 μL/s. According to H2S quenching fluorescence at 521 nm， the concentration of H2S in the sample was determined. The detected concentration range of H2S was 5.0×10 Symbolm@@ 6-8.0×10 Symbolm@@ 5 mol/L， and the detection limit was 5.4×10 Symbolm@@ 7 mol/L. Detection result of H2S in intestinal perfusion was 3.8×10 Symbolm@@ 5 mol/L with 3.1% RSD （n=3）. This method can be used for the determination of H2S effectively in the samples， which lay the foundation for real-time online measurement of H2S in biological samples.

Keywords Fiber sensing; Hydrogen sulfide; Micro sequential injection lab-on-valve; Fluorescein mercury; Fluorescence quenching

（Received 29 May 2014; accepted 5 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.8126048）endprint