兔脂肪干細胞誘導的成骨細胞復合豬小腸黏膜下層構建組織工程骨膜的實驗研究

王光楠 陳 艷 秦書儉

1.解放軍第二〇五醫院顯微外科，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫學院解剖學教研室，遼寧錦州 121001

在臨床工作中，骨缺損修復一直沒有得到很好的解決，目前常把植骨術作為主要的方法。 植骨術可以分為3 種：自體來源植骨術、同種異體或異種植骨術以及組織工程骨植骨術。 前兩種方法由于供源不足、供區損傷、移植排斥反應等影響而限制其在臨床工作中的廣泛應用，但是組織工程骨移植可以克服這些不足和弊端，成為骨缺損修復的新方法。 在組織工程骨移植中，種子細胞的性能與生物材料的選擇，以及細胞和生物材料的復合情況是最為核心的部分，關系到組織工程產品的治療效果，而以及生物產品在使用中的安全性等各個方面。

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪組織基質中的貼壁細胞，具有增殖能力強以及向多個方向分化的潛能[1-2]。其與骨髓基質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）相近的分子生物學特性[3-4]，而BMSCs 已經應用于同種異體組織工程化組織構建以及組織修復的研究，ADSCs 是否具有與BMSCs 相似的修復特性，國內外文獻少見報道。 本研究旨在探討ADSCs 誘導產生的成骨細胞與豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）支架復合構建生物活性骨膜的可行性， 為進一步應用同種異體ADSCs 誘導產生的成骨細胞為種子細胞構建組織工程骨修復骨缺損提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

成年健康日本大耳白兔10 只，體重2～2.5 kg，雌雄不限。 動物由上海SLAC 實驗動物有限公司提供，合格證號：2007000520595。

1.2 方法

1.2.1 制備豬脫細胞SIS、兔ADSCs 培養及構建組織工程骨膜

1.2.1.1 制備豬脫細胞SIS 采用物理方法處理及化學方法，按文獻[5]方法制備脫細胞小腸黏膜下層，凍干后用環氧乙烷消毒，備用。 具體方法如下：

物理方法處理：取屠宰4 h 內經過檢疫的健康成年豬的小腸，先使用清水洗凈，再挑選粗細均勻的管腔管壁沒有破損且無淋巴結的部位。 翻轉小腸，使黏膜面向外，清除小腸黏膜層直至黏膜下層暴露，再次翻轉小腸，使用包裹有紗布的刀柄去除漿膜層和肌層的組織。 用40℃水持續沖洗干凈。

化學方法：按文獻[5]方法制備，將經過上述物理方法處理后的小腸首先進行如下化學方法處理操作（以下所有操作均在室溫進行， 處理的材料與溶液的體積比要始終保持在1∶100）：將用上述物理方法處理過的SIS 浸泡在含有乙二胺四乙酸（EDTA，100 mmol/L）和氫氧化鈉（100 mmol/L）溶液中，2 周后取出；然后用去離子水沖洗干凈后，在含有鹽酸（1 mmol/L）和氯化鈉（1 mmol/L）的溶液中（pH 0～1）浸泡6～8 h；用去離子水沖洗干凈后在氯化鈉（1 mmol/L）的磷酸鹽緩沖液中浸泡16 h；用去離子水沖洗后，在磷酸鹽緩沖液中（pH 7～7.14）中浸泡2 h；再用去離子水沖洗2 h；殺菌：將SIS 在含過氧乙酸（0.1%）的乙醇溶液（20%）中浸泡8 h， 再用含0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗2 h，然后程序性降溫到-80℃，凍干后用環氧乙烷消毒，備用。

1.2.1.2 ADSCs 的獲取、原代和傳代培養及鑒定 取大白兔，麻醉取腹股溝部及腎下脂肪組織，PBS 沖洗，脂肪剪成直徑為1 mm 的3 個小塊， 置0.1%Ⅰ型膠原酶中，消化60 min，置于離心機以1000 r/min 離心10 min，棄去上清，采用含10%胎牛血清的培養基制成單細胞懸液，置恒溫培養箱常規培養。待細胞融合達80%時，1∶2 傳代，擴增培養。取第3 代細胞采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD34 的表達進行細胞鑒定。1.2.2.3 ADSCs 成骨誘導 對照組：取第3 代細胞，制成細胞懸液，DMEM 培養基（含50 μmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉以及0.1 μmol/L 地塞米松的）培養，每隔3 d 換液1 次。 倒置顯微鏡下觀察細胞基本長滿之后，用0.25%胰酶，0.01%EDTA 消化后進行傳代培養。 實驗組：培養基更換為加入成骨誘導劑的DMEM 培養基，其他步驟同對照組。

1.2.1.3 ADSCs 誘導的成骨細胞與SIS 復合 組織工程骨膜（以下用“M”表示）的復合：于操凈工作臺修剪SIS 與培養板6 孔和96 孔的孔徑大小基本一致，取6 孔及96 孔培養板，經消毒滅菌后，每孔加入BSA（600 μL/50 μL），置于37℃，5%二氧化碳培養箱中12 h后，取由ADSCs 誘導的成骨細胞，傳2 代后制成兩種濃度的細胞懸液（5×104/孔、5×103/孔），分別接種于6孔和96 孔板中，置于37℃，5%二氧化碳培養箱中復合培養10 d，每3 天更換培養液1 次。 觀察、檢測ADSCs 復合SIS 構建的M。

1.2.2 實驗結果檢測

1.2.2.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 倒置光學顯微鏡下觀察原代及傳至3 代ADSCs 的生長情況以及形態變化特點。

1.2.2.2 誘導成骨細胞檢測 成骨誘導第12 天， 每組取一塊6 孔培養板，按照堿性磷酸酶顯色試劑盒要求進行BCIP/NBT 染色，顯微鏡下觀察拍照。 對照組處理方法及時間同實驗組。

1.2.2.3 MTT 法檢測細胞的生長曲線情況 用胰酶-EDTA 消化誘導后傳至第2 代成骨細胞接種于96 孔培養板中，每孔細胞密度為3×103個，體積為200 μL/孔。每個培養板設10 孔為實驗組，6 孔設為對照組，總共接種6 板。置于二氧化碳培養箱中培養，1、3、5、7、10 d后，各取1 板，實驗組和對照組每孔加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，培養4 h 后，吸棄培養孔內培養液，每孔加入DMSO 150 μL，于自動酶標儀上（λ=490 nm）檢測各個孔的吸光度值，數據以（s）表示，橫坐標以時間，縱坐標以吸光度值制作細胞的生長曲線，觀察誘導后傳至第2 代成骨細胞生長情況。

1.2.2.4 檢測M 中的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達情況 取M 的6 孔板，從復合培養10 d 之后，分別取0、5、10、15 d 為時間點，吸除成骨誘導培養液，先用PBS 沖洗2 次，然后在各孔中加入400 μL的1%TritonX-100 溶液，放置在4℃的冰箱中過夜之后，取出50 μL 的細胞裂解液，依據檢測試劑盒說明書操作：設置空白管、標準管以及測定管；每組測定管均加入0.5 mL 的緩解液、50 μL 的細胞上清液和0.5 mL 的基質液。 在混勻之后，放置在37℃的水浴箱中孵育15 min，然后再加入105 mL 顯色劑，充分混勻后，在波長為520 nm 處測定各孔的吸光度。根據相應空白管以及標準管的吸收值計算ALP 的含量，ALP=測定管吸光度/標準管吸光度×標準管含酚量（0.1×0.005）×（100/0.005），取平均值，結果用金氏單位（U/100 mL）表示。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0 對數據進行分析， 正態分布計量資料以均數±標準差（s）表示，采用Oneway ANOVA 進行數據分析。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIS 大體形態學觀察結果

經物理機械及化學方法處理獲得的SIS 呈淺乳白色半透明薄膜狀。 見圖1、2。

圖1 物理法制成的豬小腸黏膜下層

圖2 化學處理后的干燥豬小腸黏膜下層

2.2 原代及傳代細胞細胞形態學結果

原代培養的細胞在接種8 h 后，貼壁細胞為成纖維樣形態細胞，ADSCs 則是懸浮在培養瓶的底部。 細胞接種24 h 后，ADSCs 達到85%貼壁， 體積開始小、形態為圓形透明狀態；在2～4 d 時貼壁細胞的逐漸伸展，體積逐漸增大，外形為短梭形或多角形，細胞多數為單核，而且核仁清晰，細胞之間互相連接，形態類似成纖維細胞。 在7 d 左右細胞數量明顯增多，貼壁細胞呈現團簇狀或漩渦狀排列狀態， 部分形成細胞集落，細胞形態呈現長梭形，細胞間排列緊密，常伴有2～3 個突起，細胞核大，呈扁圓形。 在接種14 d 時，貼壁的ADSCs 匯合成單層細胞，基本鋪滿于整個瓶底。部分集落細胞內可見脂肪顆粒，貼壁細胞由梭形形態逐漸變為橢圓形形態。 見圖3A～D。

傳代后細胞呈長梭型及多角形貼壁分布，形態大小較一致，突起減少，增殖迅速，一般3～4 d 即可匯合成單層，平行或漩渦狀排列。 各代細胞于形態上無明顯變化。

流式細胞表型分析結果顯示：貼壁細胞高表達間充質干細胞的特異性表面標志物CD29（93.58%），CD44（91.16%），僅表達少量的造血干細胞的特異性表面標志物CD34（0.96%），確定貼壁細胞為ADSCs。見圖3E～G。

圖3 倒置顯微鏡下脂肪干細胞一般狀態觀察及流式細胞鑒定結果

2.3 誘導的成骨細胞倒置顯微鏡觀察結果

細胞在成骨細胞誘導后， 生長速度明顯變慢，細胞形態逐漸由梭形變為三角形、多角形，有數個突起（圖4）。 隨誘導時間的延長，細胞均出現重疊生長，形成多個散在的細胞結節、基質堆積，在細胞結節中央區形成礦化結節。 對照組細胞形態無改變。

圖4 成骨細胞誘導第8 天倒置顯微鏡下細胞形態（200×）

2.4 ALP 染色觀察結果

實驗組細胞ALP 表達陽性， 表現為細胞漿被染成藍色（圖5，封三）。 對照組細胞漿未被染色（圖6，封三）。

圖5 實驗組堿性磷酸酶染色（200×）（見內文第7頁）

圖6 對照組堿性磷酸酶染色（200×）（見內文第7頁）

2.5 由ADSCs 誘導的成骨細胞生長曲線

實驗組ADSCs 誘導成骨細胞在第1～5 天， 細胞數目增殖變化不大， 第7 天起細胞大量增加達到頂點，1 周后生長速度略有減慢。 見圖7。

圖7 脂肪干細胞誘導的第2 代成骨細胞生長曲線

2.6 M 表面細胞的生長曲線

M 表面ADSCs 誘導成骨細胞在第1～3 天， 細胞數目增殖變化不大，6 d 達到峰值， 之后速度又減慢。見圖8。

2.7 ALP 定量表達結果

實驗組與對照組相比，相同時間點ALP 活性明顯增高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。 實驗組M培養后5 d 表達明顯增多，并且達到最高值，在10～15 d都有不同程度降低。 見表1。

圖8 組織工程骨膜表面細胞生長曲線

表1 兩組不同時間點的堿性磷酸酶活性比較（n = 10，U/100 mL，s）

表1 兩組不同時間點的堿性磷酸酶活性比較（n = 10，U/100 mL，s）

組別 0 d 5 d 10 d 15 d對照組實驗組P 值0.64±0.15 3.96±0.33＜0.01 0.65±0.17 9.43±4.15＜0.01 0.37±0.15 8.36±0.24＜0.01 0.76±0.17 8.05±0.33＜0.01

3 討論

骨組織工程的研究熱點是將具備良好成骨能力的種子細胞接種到生物相容性良好、有利于種子細胞黏附生長的生物支架材料上體外復合培養，從而構建出具有成骨活性的植骨材料，即組織工程化骨。 一些實驗結果顯示，具有成骨潛能的種子細胞與支架材料復合有較強的成骨能力[6]。

ADSCs 在含有成骨誘導劑的特定條件下可以向成骨細胞分化[7-12]。在本實驗中采用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸加入到基礎培養基中，作為成骨誘導分化的培養液。 地塞米松促進ADSCs 早期成骨分化是通過與干細胞上的糖皮質激素受體結合，從而激活干細胞表面的受體， 促進ADSCs 的ALP 活性表達增強。也有研究表明地塞米松通過增強其受體與基因組中靶序列的親和力從而調控分化細胞中的基因表達，提高ALP 活性，促進成骨分化。 在成骨誘導后期地塞米松可誘導干細胞發生礦化；β-甘油磷酸鈉可釋放磷酸根，為提供干細胞體外誘導培養過程中發生鈣沉積所需要的磷離子， 為細胞礦化提供離子環境，促進生理性鈣鹽沉積；抗壞血酸可以通過延長Ⅰ型膠原轉錄因子的半衰期從而使Ⅰ型膠原mRNA 的含量增加，促進膠原合成。 這些調控因子的聯合應用為ADSCs 體外成骨誘導培養提供了良好環境[13-17]。

本研究中ADSCS 在成骨誘導后， 生長速度明顯變慢，細胞形態逐漸由梭形變為三角形、多角形，有數個突起。隨誘導時間的延長，細胞均出現重疊生長，形成多個散在的細胞結節，基質堆積，在細胞結節中央區形成礦化結節。

本研究將兔的ADSCS 誘導而成的成骨細胞與SIS 復合構建組織工程骨膜后進行成骨生長特性進行了實驗研究。 實驗結果提示誘導的成骨細胞在SIS 膜上表現為M 表面細胞的生長曲線，可見M 表面ADSCs生長情況，1～3 d 增殖緩慢。證實細胞在組織工程骨膜上生長狀態很好，而且SIS 具有一定的促進成骨細胞分裂作用。

[1] Fikry EM，Safar MM，Hasan WA，et al. Bone marrow and adipose-derived?Mesenchymal stem cells alleviate methotrexate-induced pulmonary fibrosis in rat：comparison with dexamethasone [J]. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（7）：321-329.

[2] Yin Y，Zhou X，Guan X，et al. In vivo tracking of human adipose-derived stem cells?Labeled with ferumoxytol in rats with middle cerebral artery occlusion by magnetic resonance imaging [J]. Neural Regen Res，2015，10（6）：909-915.

[3] Aubin JE. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal populations' role for heterotypic cell—cell interaction in osteoblast differentiation [J]. Cell Tissue Res，1999，72（3）：396-410.

[4] Chiou GJ，Crowe C，McGoldrick R，et al.Optimization of an injectable tendon hydrogel： the effects of platelet-rich plasma and adipose-derived stem cells on tendon healing in vivo [J].Tissue Eng Part A，2015，21（9-10）：1579-1586.

[5] Abraham GA，Murray J，Billiar K，et al. Evaluation of the porcine intestinal Col layer as a biomaterial [J]. J Biomed Mater Res，2000，51（3）：442-452.

[6] Kneser U，Stangenberg L，Ohnolz J，et al.Evaluation of processed bovine cancellous bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model [J]. Cell Mol Med，2006，3（10）：695-707.

[7] Zhou H，Yang J，Xin T，et al. Exendin-4 enhances the migration of adipose-derived stem cells to neonatal rat ventricular cardiomyocyte-derived conditioned medium via the phosphoinositide 3-kinase/Akt-stromal cell-derived factor-1α/CXC chemokine receptor 4 pathway [J]. Mol Med Rep，2015，11（6）：4063-4072.

[8] Pascucci L，Mercati F，Marini C，et al. Ultrastructural morphology of equine adipose -derived mesenchymal stem cells [J]. Histol Histopathol，2010，25（10）：1277-1285.

[9] Edwards PC，Ruggiero S，Fantasia H，et al. Sonic hedgehog geneen hanced tissue engineering for bone regeneration [J]. Gene Therapy，2005，12（1）：75-86.

[10] Girolamo L，Lopa S，Arrigoni E，et al. Human adiposederived stem cells isolated from young and elderly women：their differentiation potential and scaffold interaction during in vitro osteoblastic differentiation [J]. Cytotherapy，2009，11（6）：793-803.

[11] Wall ME，Rachlin A，Otey CA，et al. Human adipose-derived adult stem cells upregulate palladin during osteogenesis and in response to cyclic tensile strain [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2007，293（5）：1532-1538.

[12] Kim YJ，Yu JM，Joo HJ，et al. Role of CD9 in proliferation and proangiogenic action of human adipose-derived mesenchymal stem cells [J]. Pflugers Arch，2007，455（2）：283-296.

[13] Lin Y，Chen X，Yan Z，et al. Multilineage differentiation of adipose-derived stromal cells from GFP transgenic mice [J]. Mol Cell Biochem，2006，285（1-2）：69-78.

[14] 朱肖奇，賀用禮，馬雪峰，等.生物衍生骨與骨髓間充質干細胞復合修復免橈骨大段缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（3）：417-422.

[15] Neubauer M，Hacker M，Bauer-Kreisel P，et al. Adipose tissue engineering based on mesenchymal stem cells and basic fibroblast growth factor in vitro[J].Tissue Eng，2005，11（11-12）：1840-1851.

[16] 劉琴，陳芳，楊麗君，等.低溫凍存對兔脂肪間充質干細胞部分生物學特性的影響[J].中國實驗動物學報，2014，22（4）：60-64.

[17] Baldursson BT，Kjartansson H，Konrádsdóttir F，et al.Healing rate and autoimmune safety of full-thickness wounds treated with fish skin acellular dermal matrix versus porcine small -intestine submucosa： a noninferiority study [J]. Int J Low Extrem Wounds，2015，14（1）：37-43.