RNA干擾沉默USP22基因對人鼻咽癌裸鼠移植瘤生長的影響

廖志偉 莊雅靖 余宏偉 喻 芳 劉孟忠 周同沖

1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，廣東廣州 510095；2.中山大學腫瘤防治中心放療科，廣東廣州 510060

泛素特異性肽酶22（ubiquitin-specific processing peptidase 22， USP22）屬于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。USP22 編碼產物在人類各種正常組織中呈現低豐度表達，在許多惡性腫瘤細胞中呈高豐度表達[1]。由于其在實體瘤中的特異性分布，可以作為腫瘤治療的新靶點。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術作為一種干預基因表達的實驗工具已廣泛用于抗腫瘤的研究。 慢病毒載體介導的基因表達或RNAi 作用持續且穩定，其作為新一代高效表達載體推進了腫瘤的基因治療研究。 本研究將CNE-2 細胞， 轉染對照質粒的CNE-2 穩定細胞株， 轉染sh-USP22 質粒的CNE-2穩定細胞株，于動物背部行皮下注射，觀察其對裸鼠移植瘤成瘤的影響， 旨在研究USP22 沉默后的體內抗腫瘤效應。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：正常CNE-2 細胞，購自中南大學湘雅中心實驗室， 培養及保存在廣州永諾生物科技有限公司。本實驗室前期研究以pLL3.7 質粒為載體，USP22 shRNA 序列靶點引自本課題組前期實驗靶序列[2-3]，針對USP22 的編碼序列設計的干擾序列如下：

sh-USP22 組：5'-AACTCACGGACAGTCTCAACAATTTCAAGAGAATTGTTGAGACTGTCCGTGTTTTTTC-3'； 3'-TTGAGTGCCTGTCAGAGTTGTTAAAGTTCTCTTAACAACTCTGACAGGCACAAAAAAGAGCT-5'。 陰性對照組：5'-AACTTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3'； 3'-TTGAAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTAAAAAAGAGCT-5'。

正常CNE-2（陰性對照），CNE-2 空載體細胞（Scrambled），USP22 表達下調穩定細胞株（sh-USP22），3 種細胞用含10%胎牛血清（GIBCO）的RPMI 1640 培養液（GIBCO）培養于CO2體積分數為5%的37℃的培養箱中。

實驗動物：6 周齡、雌性、SPF 級BALB/c 裸鼠9 只，購于中山大學實驗動物中心。 動物合格證編號：No.44008500006768，飼養于中山大學實驗動物中心。 在無特殊病原條件（SPF）下飼養，飼料及水均自由攝入且經過嚴格的滅菌處理。

1.2 裸鼠體內成瘤實驗方法

取對數生長期細胞，消化后，PBS 重懸離心，去除血清，最后將細胞重懸于PBS 溶液中，調整密度為5×107個/mL。 100μL 細胞懸液，于動物右側背部行皮下注射。

實驗分組：陰性對照組，CNE-2 空載體細胞株組（Scrambled 組），USP22 表達下調穩定細胞株組 （sh-USP22 組），每組3 只裸鼠。從第2 周開始每周測量腫瘤體積變化，第8 周結束實驗，斷頸處死裸鼠，剝取腫瘤，稱重，凍存備用。 根據公式V=1/2（a×b2）計算腫瘤體積（V 代表瘤體積，a 為長徑，b 為短徑）。

1.3 RT-PCR 檢測USP22 mRNA 的水平

按照Trizol 試劑說明書（Invitrogen 公司）提取腫瘤組織的總RNA，采用Promega 公司的M-MLV 逆轉錄酶進行逆轉錄反應， 用RT-PCR Quick Master Mix（Toyobo 公司）進行PCR 反應。

以Primer 5.0 軟件設計引物，委托英駿生物技術有限公司合成，引物序列如下：

USP22-F：5'-CCATTGATCTGATGTACGGAGG-3'；USP22-R：5'-TCCTTGGCGATTATTTCCATGTC-3'；GAPDH-F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'；GAPDH-R：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

反應體積包括：正反引物各1 μL，cDNA 產物1 μL，Taq 混合物25 μL，去RNA 酶去離子水22 μL，震蕩混勻后放入PCR 儀中，調整好反應程序。 執行擴增。一般： 在93℃預變性3～5 min， 進入循環擴增階段：93℃40 s→58℃30 s→72℃60 s， 循環30～35 次，最后在72℃時保溫7 min。 PCR 產物于4℃保存待電泳檢測。 PCR 產物在質量分數為2%的瓊脂凝膠中，80 V恒壓電泳30 min，在凝膠圖像成像系統觀察結果。 記錄結果并進行灰度分析。 選取GAPDH 做內參，采用灰度分析計算USP22 相對表達量。

1.4 免疫組化檢測USP22 蛋白的表達

分離得到的腫瘤用甲醛固定、組織包埋、石蠟切片、經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、熱抗原修復。 分別檢測各組織切片中USP22 的表達，具體步驟按VECTASTAIN ABC Kit （Vector laboratories 公司）試劑盒的說明書進行。 一抗為1∶200 兔抗人USP22 抗體（ab71732，Abcam 公司）， 二抗為羊抗兔IgG 抗體-HRP多聚體。上述各步驟間用PBS 緩沖液洗片3 次、DAB 顯色、蘇木精復染、光鏡下觀察結果。將細胞漿內棕黃色顆粒超過腫瘤細胞漿體積1/4 者計為陽性細胞，統計500 個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞百分比。

2 結果

2.1 裸鼠皮下移植瘤的生長情況及生長曲線測定腫瘤的生長

通過測量腫瘤長短徑計算腫瘤體積，繪制出3 組皮下瘤生長曲線。 腫瘤生長曲線顯示，sh-USP22 組腫瘤體積明顯小于陰性對照組和Scrambled 組， 隨著接種時間的延長，差異越來越明顯。 見表1。

表1 各組裸鼠腫瘤體積的變化（mm3，）

表1 各組裸鼠腫瘤體積的變化（mm3，）

組別 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周第2 周只數陰性對照組Scrambled 組sh-USP22 組333 124.25±11.82 114.05±10.26 104.35±9.39 280.65±19.64 236.25±14.17 168.05±14.28 578.05±63.58 448.05±49.28 245.25±26.97 815.00±73.35 749.65±89.96 321.45±32.14 1208.45±120.85 985.35±86.71 434.85±36.53 1426.05±171.13 1255.45±100.43 501.75±48.67 1651.55±214.70 1448.00±188.24 589.00±64.79

終點時間第8 周斷頸處死裸鼠后剝離瘤體，sh-USP22 組腫瘤重量（0.54±0.07）g 明顯小于陰性對照組（1.58±0.24）g 和Scrambled 組（1.46±0.23）g，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見圖1。

圖1 鼻咽癌細胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生長曲線和瘤體比較

2.2 半定量RT-PCR 檢測USP22 mRNA 水平的變化

獲取腫瘤后，進行半定量RT-PCR，以瓊脂糖電泳條帶的亮度來判斷USP22 mRNA 水平高低。 sh-USP22 移植瘤組織出現很弱的特異性條帶，而陰性對照組和Scrambled 組移植瘤組織條帶明顯較亮。 以GAPDH 為參照基因，分析凝膠成像圖像的灰度值，將獲得的目的基因灰度與參照基因灰度的比值作為表達量。 結果分析表明， 以陰性對照組表達量為參照（1），sh-USP22 組腫瘤組織中USP22 mRNA 相對表達量（0.14±0.09）低于陰性對照組和Scrambled 組（0.92±0.11），差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；而陰性對照組和Scrambled 組（0.92±0.11）比較，差異沒有統計學意義（P ＞0.05）。

圖2 半定量RT-PCR 檢測3 組裸鼠移植瘤組織中USP22 mRNA 的表達

2.3 免疫組織化學法檢測移植瘤內USP22 蛋白表達的變化

USP22 蛋白染色陽性為深黃色或棕黃色，主要位于細胞質內。 免疫組化染色后可見陰性對照組和Scrambled 組裸鼠皮下移植瘤組織中有較多棕黃色顆粒，細胞胞質中可見明顯棕黃色染色。而sh-USP22 組裸鼠皮下移植瘤中，陽性染色細胞減少，細胞漿內著色顆粒明顯少于陰性對照組和Scrambled 組， 包漿黃色明顯減弱、變淺，表明注射pLL-shRNA 后人鼻咽癌裸鼠移植瘤中的USP22 蛋白表達下降。 見圖3（封三）。

圖3 免疫組織化學法檢測移植瘤組織中USP22 的表達情況（200×）

將細胞漿內棕黃色顆粒超過腫瘤細胞漿體積的1/4 者計為陽性細胞，統計500 個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞百分比。 sh-USP22 組（12.45±1.16）%腫瘤組織中USP22 陽性細胞所占比率明顯低于陰性對照組（97.25±1.94）%和Scrambled 組（91.28±2.75）%，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；陰性對照組（97.25±1.94）%和Scrambled 組 （91.28±2.75）%比較，差異沒有統計學意義（P ＞0.05），表明USP22 表達明顯降低，USP22 shRNA 抑制了USP22 的表達。見圖4。

3 討論

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤，放射治療是鼻咽癌最主要的治療方法[4-5]。轉移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因[6]。闡明鼻咽癌發生的分子機制，從而采取有效的干預措施控制轉移一直是鼻咽癌研究的重點。 隨著分子生物學技術的發展，從基因水平調控腫瘤的生長成為科學家們的重點研究方向。

圖4 各組USP22 陽性細胞所占比率

Glinsky 等[7]通過mRNA 微集陣列技術在多種癌組織中研究證明了一組包含11 個基因的癌死亡標簽，USP22 作為其中一員而引起高度關注。 人類USP22 基因定位于人17 號染色體上，由14 個外顯子組成，其編碼蛋白表達于細胞核，具有去泛素化的作用，可以使泛素從復合物中脫離。 USP22 通過去泛素化修飾達到調節細胞周期和促進腫瘤增殖的作用，其作為細胞信號網絡中的樞紐分子很可能是多種細胞癌變、浸潤的重要環節之一[8-11]。

文獻發現USP22 在多數惡性腫瘤細胞中表達普遍升高，并且其表達水平與結直腸癌[12]、宮頸癌[13]、肺癌[14]、甲狀腺癌[15]、腦膠質瘤[16]、乳腺癌[17]、食管癌[17]、胃癌[18]、卵巢癌[19]、胰腺癌[20]等惡性腫瘤的預后有密切的關系，USP22 表達增高者預后差。 USP22 可以通過上皮間質轉化（EMT）促進肺癌增殖、侵襲[21]。 本實驗前期研究發現，USP22 的mRNA 及蛋白水平在多個鼻咽癌細胞系（CNE-1，CNE-2）中均較正常鼻咽上皮細胞（NPEC）明顯升高，為進一步肯定這一現象，本研究檢測了正常鼻黏膜及鼻咽癌組織中USP22 水平，結果與細胞系一致，鼻咽癌組織USP22mRNA 及蛋白水平均上調。 更進一步的研究發現，抑制USP22 的表達使鼻咽癌細胞株生長增殖能力降低，USP22 通過使AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cyclinD1 表達下調和GSK-3β、AKT 上調而調控細胞生長增殖周期[2]。 因此，研究者認為USP22 對鼻咽癌發生發展可能有重要影響， 下調USP22 基因水平能對腫瘤起治療作用。

RNAi 作為一種簡單有效的基因敲除方法， 能夠高效、特異沉默目的基因，使突變基因穩定沉默而不影響正?；虻谋磉_，已成為基因功能研究的有力工具。 慢病毒載體介導的RNAi 作用持續且穩定，能達到良好的基因治療效果，具有廣闊的應用前景。 既往研究已成功構建并鑒定USP22 sh-RNA 慢病毒載體，包裝成適合感染目的細胞的慢病毒顆粒，為進一步研究USP22 基因在人鼻咽癌細胞中的作用機制打下堅實的基礎[3]。

本研究選用BALB/c 裸鼠作為體內實驗的動物模型，具有易成瘤、易飼養、相對穩定等優點。 通過觀察并記錄各組裸鼠種植瘤的生長情況， 研究者發現在USP22 基因表達沉默后，裸鼠成瘤時間晚，瘤體生長明顯減緩。 提示沉默USP22 基因表達可使人鼻咽癌細胞株CNE-2 裸鼠移植瘤生長受到抑制。 RT-PCR和免疫組化的結果從mRNA 水平和蛋白水平顯示pLL-shRNA-USP22 能明顯抑制腫瘤組織中USP22的表達， 進一步說明USP22 在鼻咽癌的發展中可能起著重要的促進作用。

綜上所述，本研究以pLL3.7 慢病毒質粒為載體，成功構建了重組表達質粒pLL-shRNA-USP22， 通過慢病毒介導的sh-RNA 沉默人鼻咽癌CNE-2 細胞中USP22 基因表達， 可以在裸鼠體內抑制腫瘤的生長。雖然對人體而言， 鼻咽癌瘤塊內直接注射pLLshRNA-USP22 的方法并不可行， 但本研究為臨床利用小RNA 干擾技術治療鼻咽癌提供了新的治療思路，USP22 基因有望成為鼻咽癌治療的新靶點。

[1] Lee HJ，Kim MS，Shin JM，et al. The expression patterns of deubiquitinating enzymes，USP22 and Usp22 [J]. Gene Expr Patterns，2006，6（3）：277-284.

[2] Zhuang Y，Liao Z，Yu H，et al. ShRNA-mediated silencing of the ubiquitin-specific protease 22 gene restrained cell progression and affected the Akt pathway in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Biology&Therapy，2014，16（1）：88-96.

[3] 余宏偉，廖志偉，莊雅靖，等.USP22 ShRNA 慢病毒載體的構建及鑒定[J].中國當代醫藥，2014，21（32）：9-12，15.

[4] 廖志偉，周同沖，宋先璐，等.尼妥珠單抗聯合順鉑同步放化療治療鼻咽癌的臨床研究[J].中國醫藥導報，2013，10（10）：71-73.

[5] 岳海振，賈飛，張健，等.鼻咽癌容積調強放射治療劑量驗證比較研究[J].北京生物醫學工程，2013，32（4）：375-379.

[6] 艾芬，陳陣.正電子計算機體層掃描與核磁共振成像診斷國人鼻咽癌轉移的Meta 分析[J].中國醫藥導報，2014，11（2）：81-84.

[7] Glinsky GV，Berezovska O，Glinskii AB. Microarray analysis identifies a death-from-cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer [J].J Clin Invest，2005，115（6）：1503-1521.

[8] Liu YL，Jiang SX，Yang YM，et al. USP22 acts as an oncogene by the activation of BMI-1-mediated INK4a/ARF pathway and Akt pathway[J].Cell Biochem Biophys，2012，62（1）：229-235.

[9] Liu Y，Yang Y，Xu H，et al. Implication of USP22 in the regulation of BMI-1， c-Myc， p16INK4a， p14ARF， and cyclin D2 expression in primary colorectal carcinomas [J].Diagn Mol Pathol，2010，19（4）：194-200.

[10] Zhang XY，Varthi M，Sykes SM，et al. The putative cancer stem cell marker USP22 is a subunit of the human SAGA complex required for activated transcription and cell-cycle progression[J].Mol Cell，2008，29（1）：102-111.

[11] Schrecengost RS，Dean JL，Goodwin JF，et al. USP22 regulates oncogenic signaling pathways to drive lethal cancer progression [J]. Cancer Res，2014，74（1）：272-286.

[12] Liu YL，Yang YM， Xu H，et al. Aberrant expression of USP22 is associated with liver metastasis and poor prognosis of colorectal cancer[J].J Surg Oncol，2011，103（3）：283-289.

[13] Yang M，Liu YD，Wang YY，et al. Ubiquitin-specific protease 22：a novel molecular biomarker in cervical cancer prognosis and therapeutics[J].Tumour Biol，2014，35（2）：929-934.

[14] Ning J，Zhang J，Liu W，et al. Overexpression of ubiquitin-specific protease 22 predicts poor survival in patients with early-stage non-small cell lung cancer [J]. Eur J Histochem，2012，56（4）：e46.

[15] Wang H，Li YP，Chen JH，et al. Prognostic significance of USP22 as an oncogene in papillary thyroid carcinoma[J].Tumour Biol，2013，34（3）：1635-1639.

[16] Liang J，Zhang X，Xie S，et al. Ubiquitin-specific protease 22：a novel molecular biomarker in glioma prognosis and therapeutics [J]. Med Oncol，2014，31（4）：899.

[17] Zhang Y，Yao L，Zhang X，et al. Elevated expression of USP22 in correlation with poor prognosis in patients with invasive breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011，137（8）：1245-1253.

[18] 鄧美洲，陶凱雄，王國斌，等.泛素特異性肽酶22 在胃癌中的表達及其臨床意義[J].腹部外科，2011，24（5）：302-303.

[19] Ji M，Shi H，Xie Y，et al. Ubiquitin specific protease 22 promotes cell proliferation and tumor growth of epithelial ovarian cancer through synergy with transforming growth factor beta1 [J]. Oncol Rep，2015，33（1）：133-140.

[20] Ning Z，Wang A，Liang J，et al. USP22 promotes the G1/S phase transition by upregulating FoxM1 expression via beta-catenin nuclear localization and is associated with poor prognosis in stage Ⅱpancreatic ductal adenocarcinoma [J]. Int J Oncol，2014，45（4）：1594-1608.

[21] Hu J，Yang D，Zhang H，et al. USP22 promotes tumor progression and induces epithelial-mesenchymal transition in lung adenocarcinoma [J]. Lung Cancer，2015，88（3）：239-245.