金水鮮凍干粉懸液聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌C-33A細(xì)胞的生物學(xué)影響

宋 建 戈 偉 劉 梁

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，湖北武漢 430060

子宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，手術(shù)和放療作為局部治療不能控制子宮頸癌的亞臨床病灶，導(dǎo)致中、晚期子宮頸癌的治療效果較差，而化療作用于全身組織器官殺滅腫瘤，通過(guò)特殊的給藥方式還可以提高藥物的局部濃度，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療具有重要的抗宮頸癌活性[1-2]，有報(bào)道單獨(dú)使用其反應(yīng)率達(dá)23%～50%[2-3]，順鉑作為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物[4]，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，但是毒副作用較大。 金水鮮作為國(guó)家自主研發(fā)的中藥，承合傳統(tǒng)的中醫(yī)扶正蕩邪理論，經(jīng)濟(jì)且低毒，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金水鮮凍干粉能夠增強(qiáng)對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感的肺癌細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]，是否同樣會(huì)增強(qiáng)對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感的宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用不得而知，因此本研究聯(lián)合使用金水鮮凍干粉以及順鉑觀察對(duì)宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)影響，以分析其是否對(duì)宮頸癌細(xì)胞化療效果有增強(qiáng)作用，為將來(lái)臨床的聯(lián)合用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

人源宮頸癌C-33A 細(xì)胞株：購(gòu)自美國(guó)ATCC。 臨床用金水鮮凍干粉（北京建生藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)，批號(hào)：20140821），分裝成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的藥物懸液。 取0.3 mg 順鉑（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司， 批號(hào)：H39021357） 溶解于0.9%氯化鈉溶液10 mL 中，配成終濃度30 μg/mL 溶液。 主要實(shí)驗(yàn)試劑有RPMll640 培養(yǎng)液 （GIBCO）、 胎牛血清（GIBCO）、CCK-8 試劑盒 （北京世紀(jì)康為世紀(jì)生物科技有限公司）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，C230）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）、p21 一抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）、p53 一抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）、HRP-羊抗兔IgG（Santa Cruz 公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌C-33A 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS（胎牛血清）的RPMI l640 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃靜置培養(yǎng)， 細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d 后換液，5～7 d 后進(jìn)行傳代， 用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為實(shí)驗(yàn)所需密度，向6 cm 培養(yǎng)皿中加入5 mL 完全培養(yǎng)基， 細(xì)胞傳代時(shí)向管中加入80 μL 臺(tái)盼藍(lán)溶液，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，同時(shí)判斷細(xì)胞密度及存活率，細(xì)胞狀態(tài)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖-毒性 在96 孔板中配置100 μL 的宮頸癌單細(xì)胞懸液， 每孔約2500 個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2），向培養(yǎng)板加入10 μL 不同濃度（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）的藥物混合液（實(shí)驗(yàn)組），將96 孔板在培養(yǎng)箱孵育24 h，每孔加10 μL CCK 溶液后，繼續(xù)孵育1 h，避光的條件下，24 h 內(nèi)測(cè)定使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A），CCK-8計(jì)算各藥物作用12、24、48 h 和96 h 后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=（對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A 值×100%， 使用CCK-8 篩選最佳金水鮮單藥抑制濃度，進(jìn)而計(jì)算聯(lián)合藥物金水鮮凍與順鉑處理后對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制效率。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況 蛋白樣品制備，①對(duì)照組：向培養(yǎng)液中加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照組。 ②金水鮮組：向培養(yǎng)液中加入0.5 mg/mL 濃度的金水鮮凍干粉注射液1 mL。③順鉑組：根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，順鉑藥物濃度設(shè)定為30 μg/mL，每10 厘米培養(yǎng)液中加入順鉑混懸液1 mL。 ④金水鮮聯(lián)合順鉑組，劑量同②、③，同時(shí)加入培養(yǎng)基中處理；于第48 小時(shí)收集細(xì)胞。 采用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，制備10%分離膠和5%濃縮膠灌注，電泳緩沖液中80 V 電泳，170 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉中封閉，一抗孵育4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。第2 天加入二抗孵育液，室溫濕盒中孵育2 h，之后于生物發(fā)光影像分析儀掃描成像。

1.2.4 PI 染色檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化 4℃條件下，1500 r/min 離心5 min 后收集細(xì)胞， 棄上清， 用預(yù)冷PBS 洗細(xì)胞兩次，預(yù)冷的70%乙醇于-20℃固定過(guò)夜，次日4℃，1500 r/min 離心5 min 后收集細(xì)胞， 繼續(xù)以每管1 mL 的PBS 洗細(xì)胞1 次，再加入500 μL PBS 含50 μg/mL 溴化乙錠（PI）細(xì)胞染色，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min，上機(jī)進(jìn)行流式分析，一般計(jì)數(shù)2 萬(wàn)～3 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件Modfit 分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

從圖1 中看出， 宮頸癌細(xì)胞使用金水鮮凍干粉0.1、0.2 mg/mL 處理12、24 h 后， 抑制活性均較低，具有時(shí)間梯度依賴(lài)性的腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果， 另外，從圖1 中還顯示出金水鮮藥物濃度梯度依賴(lài)性對(duì)宮頸癌C-33A 增殖活力的影響， 尤其在在處理48 h時(shí)，藥物濃度為0.5 mg/mL 的條件下，二者可以協(xié)同發(fā)揮最大效果的抑制細(xì)胞增殖效率并達(dá)到61.2%，然而繼續(xù)增加濃度， 并不能繼續(xù)提高細(xì)胞抑制效率，考慮藥物濃度的飽和作用影響了更高藥物作用的發(fā)揮，與0.1、0.2 mg/mL 金水鮮組比較 （19.8%比37.6%），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。如圖2 所示，為了證明篩選出的合適的最佳藥物處理濃度具有更好的協(xié)同增效作用， 本研究采用0.5 mg/mL 金水鮮凍干粉聯(lián)合順鉑30 μg/mL 繼續(xù)進(jìn)行CCK-8 實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合藥物在處理48 h 后上機(jī)檢測(cè)， 金水鮮聯(lián)合順鉑組對(duì)細(xì)胞的抑制率達(dá)82.05%，與單用金水鮮（52.41%）比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），而與單獨(dú)的化療藥物順鉑作用效果（65.24%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），提示在一定程度范圍內(nèi)，金水鮮凍的藥物懸液可以明顯增加順鉑的藥物效力。

圖1 不同濃度金水鮮凍干粉處理宮頸癌C-33A 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)抑制率比較

2.2 各組宮頸癌C-33A 細(xì)胞胞p53、p21 等蛋白表達(dá)量的比較

金水鮮聯(lián)合順鉑組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53、p21在實(shí)驗(yàn)因素處理48 h 后表達(dá)明顯上調(diào)， 較金水鮮組和對(duì)照組效果明顯（P ＜0.05）。 見(jiàn)圖3、表1。

2.3 各實(shí)驗(yàn)處理組的細(xì)胞周期變化

圖2 不同藥物處理48 h 后宮頸癌C-33A 細(xì)胞增殖抑制率比較

圖3 各組宮頸癌C-33A 細(xì)胞p53、p21、GAPDH 表達(dá)情況

表1 各組p53、p21、GAPDH 蛋白表達(dá)水平比較（）

表1 各組p53、p21、GAPDH 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與金水鮮組比較，#P ＜0.05；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

組別 p21 p53 GAPDH對(duì)照組（n=3）金水鮮組（n=3）順鉑組（n=3）金水鮮聯(lián)合順鉑組（n=3）5679±445 7973±451 13 534±425 27 165±435*#5432±335 6878±395 12 334±362 22 105±373*#11 231±214 11 032±185 11 187±395 10 985±275

金水鮮聯(lián)合順鉑組細(xì)胞周期的分布在實(shí)驗(yàn)因素處理48 h 后呈明顯差異，其中細(xì)胞在G1期明顯阻滯（55%），較金水鮮組（45%）和對(duì)照組（37%）效果明顯（P ＜0.05），考慮金水鮮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯實(shí)現(xiàn)的。 見(jiàn)圖4。

3 討論

宮頸癌占的發(fā)病率女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以上，呈逐年上升趨勢(shì)，趨于年輕化[7]，早期的時(shí)候主要通過(guò)手術(shù)治療， 在中晚期的時(shí)候主要通過(guò)放化療，但疾病的治療效果依然沒(méi)有顯著性提高，順鉑是臨床上婦科惡性腫瘤最主要的抗癌藥物[8]，隨著療效的凸顯，劑量限制性毒性主要為腎毒性[2,9]，使用順鉑的患者會(huì)出現(xiàn)顯著的尿微量蛋白升高，前期的研究發(fā)現(xiàn)金水鮮可以改善患者的惡性腫瘤癥狀，減輕不良反應(yīng)，縮短機(jī)體免疫恢復(fù)造血能力恢復(fù)的時(shí)間，這些優(yōu)點(diǎn)為臨床聯(lián)合使用順鉑為基礎(chǔ)的化療提供了可能性[10]。

圖4 各組處理48 h 后的細(xì)胞周期分布

金水鮮作為天然類(lèi)藥物，是中國(guó)癌癥研究基金會(huì)北京鮮藥研制中心與清華大學(xué)生命科學(xué)與工程研究院共同研制的鮮動(dòng)植物藥劑，提取鮮蛤蚧、鮮金錢(qián)白花蛇、冬蟲(chóng)夏草、鮮西洋參等藥品中的高效抗癌生物活性物質(zhì)入藥，近年來(lái)的研究及臨床應(yīng)用表明多靶點(diǎn)地針對(duì)DNA 損傷修復(fù)， 還可以阻滯腫瘤細(xì)胞S 期分裂，從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上講其適用于氣陰兩虛、肺腎不足所致的病癥。傳統(tǒng)臨床用于肺癌患者及化療的合并用藥[11]。 既往已有的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證明其可能通過(guò)增強(qiáng)遲發(fā)超敏反應(yīng)、調(diào)節(jié)T、B 細(xì)胞增殖、刺激腫瘤壞死因子分泌等途徑提高機(jī)體的免疫功能，從而增強(qiáng)了機(jī)體自身的抗腫瘤能力，顯著地抑制腫瘤細(xì)胞；其次金水鮮通過(guò)對(duì)抗化療副作用，產(chǎn)生減毒增效的作用[6,12]。

已有的研究報(bào)道在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，金水鮮聯(lián)合放療對(duì)肺癌等實(shí)體瘤的生長(zhǎng)有放療協(xié)同作用[12]，本研究中主要通過(guò)順鉑聯(lián)合金水鮮藥物懸液在宮頸癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的形式，通過(guò)繪制腫瘤細(xì)胞增殖抑制率曲線，觀察到在不同濃度金水鮮懸液作用下，宮頸癌細(xì)胞的倍增活力較對(duì)照組明顯減慢，并且隨著劑量的遞增，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的抑制作用亦呈增強(qiáng)趨勢(shì)并存在著劑量效應(yīng)關(guān)系[6,13]。 故從金水鮮的濃度梯度和時(shí)間梯度方面證實(shí)其單獨(dú)抑制癌細(xì)胞增殖的有效性，選取了適合體外細(xì)胞聯(lián)合治療的濃度和時(shí)間，進(jìn)一步驗(yàn)證金水鮮聯(lián)合順鉑藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制協(xié)同作用以及分析其協(xié)同作用的可能機(jī)制，取得了比較好的研究結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)， 不論單用化療藥物還是單用抗癌鮮藥，都較強(qiáng)地抑制了癌細(xì)胞的增殖活力，考慮在機(jī)制協(xié)同方面有相互的促進(jìn)作用，隨后本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)分析和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)找到了可能的協(xié)同機(jī)制。

一個(gè)細(xì)胞周期包括有絲分裂期（M）和分裂間期（G1、S、G2），流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期各時(shí)相中，宮頸癌C-33A 細(xì)胞在藥物處理后，S～G2期所占比例較對(duì)照組減少，G1時(shí)相增加，實(shí)驗(yàn)鏡下觀察過(guò)程中本研究通過(guò)高倍顯微鏡觀察金水鮮懸液作用下的宮頸癌細(xì)胞，核質(zhì)比例減小，表明單用金水鮮或聯(lián)合順鉑后對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA 合成早期以及細(xì)胞復(fù)制所需要的蛋白質(zhì)成分有明顯的阻斷作用。 通過(guò)對(duì)宮頸癌C-33A細(xì)胞細(xì)胞周期的凋亡趨勢(shì)分析看到， 與對(duì)照組比較，使用化學(xué)藥處理的細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的sub-G1峰，提示細(xì)胞的凋亡并不明顯， 但是在DNA 復(fù)制晚期S 期的細(xì)胞所占比例明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)藥物作用下， 腫瘤細(xì)胞的DNA 合成晚期是藥物主要的作用靶點(diǎn)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖分裂減慢。

眾所周知， 細(xì)胞周期進(jìn)程中有3 個(gè)檢查點(diǎn)，即G1～S、S～G2、G2～M 的過(guò)渡[14-15]。 在這3 個(gè)檢查點(diǎn)上，基因及其蛋白產(chǎn)物調(diào)控著細(xì)胞周期進(jìn)程[16]。 p53 蛋白在G1～S 過(guò)渡中起關(guān)鍵作用[10]。 p2l 蛋白中p53 下游基因的蛋白產(chǎn)物，是周期素依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑[17]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)金水鮮藥物懸液和順鉑藥物聯(lián)合處理，能夠改變實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株細(xì)胞周期的分布形式， 呈現(xiàn)明顯的G1期阻滯， 而于細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白如p21、p53 蛋白等則呈現(xiàn)明顯的積聚。考慮聯(lián)合藥物處理可能為未來(lái)的婦科腫瘤的臨床治療提供一定程度的借鑒[11,18]。

金水鮮通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的平衡來(lái)提高其抗腫瘤效果，符合現(xiàn)代腫瘤生物治療新模式，是否還存在其他的細(xì)胞信號(hào)通路仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[19]，以及在對(duì)宮頸腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面的生物學(xué)影響仍然需要研究其和腫瘤表型之間的關(guān)系[20-22]，下一步擬開(kāi)展更詳細(xì)的計(jì)劃，為臨床合理科學(xué)地使用中成藥聯(lián)合現(xiàn)代化療藥物提供理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞及分子生物學(xué)水平證實(shí)了以金水鮮為主要成分聯(lián)合傳統(tǒng)的化療藥物治療宮頸癌細(xì)胞惡性表型的可能性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確實(shí)證實(shí)其協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的作用，但仍需在動(dòng)物模型上進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)的驗(yàn)證和重復(fù)。

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