藥物基因組學方程對上海患者華法林抗凝治療穩定劑量預測準確性的評估

莊文芳，陳燕紅，羅瑞萍，吳婧，宣彬彬，曹雅楠，楊莉，盛慧明

(上海交通大學醫學院附屬同仁醫院檢驗科，上海200335)

藥物基因組學方程對上海患者華法林抗凝治療穩定劑量預測準確性的評估

莊文芳，陳燕紅，羅瑞萍，吳婧，宣彬彬，曹雅楠，楊莉，盛慧明

(上海交通大學醫學院附屬同仁醫院檢驗科，上海200335)

目的在接受華法林抗凝治療肺栓塞和心顫患者的上海患者人群中，驗證華法林藥物基因組學穩定劑量預測方程的準確性。方法收集已達華法林穩定劑量的198例患者完整的臨床資料，采集每位患者枸櫞酸鈉抗凝1∶9抗凝的外周血1.8 mL，抽提全血基因組DNA后采用高分辨率溶解曲線法檢測其VKORC1-1173C＞T和CYP2C9*2、CYP2C9*3基因型。采用較多使用的符合篩選條件的4個華法林穩定劑量預測模型[包括IWPC模型(基于混合種群構建)、WEN模型(基于中國臺灣人群構建)、HUANG模型(基于中國大陸人群構建)及OHNO模型(基于日本人群構建)]。采用絕對誤差均值(MAE)和預測百分比2個指標評價并比較各模型預測準確性。結果在4個預測模型中，HUANG、OHNO及WEN 3個預測模型及固定劑量方案計算的MAE＜±1.0 mg/d，理想預測百分比＞40%，其中MAE最低的模型為HUANG模型。理想預測百分比最高的模型為OHNO。結論采用亞洲人群建立的基因導向結合基本臨床資料的華法林穩定劑量預測模型可以較好預測服用華法林的部分上海患者的藥物劑量，具有一定臨床應用價值。

華法林;基因型;藥物基因組學;劑量預測模型;CYP2C9;VKORC1

華法林是臨床上廣泛應用的抗凝劑，可用于治療房顫、深靜脈血栓、肺栓塞和瓣膜移植等的血栓形成[1]，且價格便宜。但是華法林個體藥物代謝能力的差異很大，治療安全范圍狹窄，影響其藥效的因素又很多，使得華法林個體劑量的變動性很大(0.5～60 mg/d)，存在嚴重的潛在出血和抗凝不足導致栓塞的風險，使得華法林治療的管理具有挑戰性[2-3]。影響華法林穩定劑量的因素有多種，包括年齡、身高、體重、飲食、疾病狀態、合并用藥、吸煙、喝酒、遺傳因素等。其中遺傳因素是導致不同種族以及同一種族不同個體間劑量差異的最主要原因[3]。

為了減少不良反應發生，實現個體化給藥目標，全球范圍內已經發表了多種華法林穩定劑量預測模型[4-9]，這些模型大多為基于VKORC1和CYP2C9基因型以及一些非遺傳因素而構建的多元線性回歸方程，可以解釋約40%～60%的華法林個體差異。由于對這些模型驗證的病例數不多，且未見針對上海人群的驗證，而我們的前期研究證明不同地區的人群不僅基因分布不同，其模型進行的外部驗證的效果也不同[3]。為此，我們針對上海地區就診于本院的肺栓塞和心顫患者，且已達到華法林穩定劑量，從已有模型中選取4個華法林穩定劑量預測的典型模型進行預測準確性的驗證。

材料和方法

一、研究對象與病例入選標準

2012年5月至2013年2月共收集上海交通大學醫學院附屬同仁醫院服用華法林進行抗凝治療的肺栓塞和心顫患者198例，其中男100例、女98例，年齡22～89歲，身高130～183 cm，體重38～100 kg。所有患者在服用華法林穩定劑量下，連續監測國際標準化比值(international normal ratio，INR)至少2次，每次監測間隔超過1周，且INR均在目標范圍(1.5～3.0)內。

就診的肺栓塞或心顫患者年齡≥18歲，肝腎功能、血小板計數均正常，穩定抗凝3個月以上，達到華法林穩定劑量，目標INR在1.5～3.0范圍內。所有患者均無合并腫瘤或嚴重出血病史，且無服用胺碘酮等與華法林產生相互作用的藥物。所有患者均簽署知情同意書。本研究經上海交通大學醫學院附屬同仁醫院倫理委員會批準。

二、臨床資料收集

通過查閱病歷資料、直接詢問、電話咨詢等方式收集患者完整的臨床資料，包括性別、年齡、身高、體重、合并疾病(高血壓、糖尿病、冠心病、心房顫動)以及合并用藥情況等。

三、主要儀器及試劑

基因組DNA小量抽提試劑盒(天根生物科技有限公司);Taq DNA聚合酶(Takara大連寶生物公司);SYTO9熒光染料(英駿生物工程有限公司);所有引物均由上海英駿生物工程有限公司合成;Eppendorf基因擴增儀;Rotor-Gene Q熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(凱杰QIAGEN生物技術有限公司)。

四、方法

1.血標本采集收集入選受試者的靜脈血1.8 mL，109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，用于檢測PTINR值及CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC 13個SNP位點鑒定。

2.基因組DNA提取及PCR擴增取外周抗凝血2 mL，使用全血基因組DNA小量抽提試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。CYP2C9*2 (rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)及VKORC1-1173C＞T(rs9934438)3個SNP位點的PCR引物設計參照文獻[3]，見表1。PCR反應體系總體積為20 μL，Premix混合液10 μL;正、反引物均為0.5 μmol/L;基因組DNA 10 ng。PCR采用兩步法:95℃預變性3 min;95℃30 s，60℃30 s;72℃延伸1 min;40個循環。

3.高分辨熔解曲線分析PCR結束后，加染料SYTO9綠色熒光核酸染料(invitrogen)進行預雜交(90℃5 s，40℃30 s)，然后從80℃熔解到90℃，溫度變化速率為0.1℃/s。應用Rotor Gene 6000 1.7軟件進行實時數據檢測和分析，依據熔解曲線和熔解峰進行基因分型，野生型和純合突變型熔解峰為單峰，雜合突變型為雙峰。

表1 SNP位點引物序列

4.INR值測定INR測定結果由上海交通大學醫學院附屬同仁醫院血液實驗室提供。使用日本東亞CA-7000全自動凝血儀(凝固法)測定。

5.已發表模型的篩選華法林服用劑量的預測模型共有3種不同的內涵[1]:一是穩定劑量預測模型，即最常用的華法林遺傳藥理學模型;二為起始劑量預測模型;三是穩定劑量的精確模型，即在起始劑量用藥后3 d根據INR結果對穩定劑量做出的劑量精確模型。目前，全球范圍內已經發表了多種穩定劑量預測模型[4-9]，我們選擇了其中經驗證適合中國人群的第1種內涵的穩定劑量預測模型的4個公式。非遺傳因素為臨床上常規采集資料;遺傳因素包括VKORC1-1173C＞T (rs9934438)、CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9 *3(rs1057910)基因型。4個模型中IWPC模型[4]基于混合種群構建，WEN模型[5]基于中國臺灣人群構建，HUANG模型[6]基于中國大陸人群構建;OHNO模型[7]基于日本人群(亞洲)構建。各模型特點見表2[9]。

表2 4個典型模型特點列表

五、4個模型的公式

1.IWPC模型IWPC包括9個國家的21個研究小組，提供了用華法林治療的5 000多例患者的臨床和遺傳學數據[4]，由此得到的遺傳藥理學模型預測需要低劑量(≤21 mg/周)或高劑量(≥49 mg/周)治療的患者，結果顯著優于臨床模型預測。公式:劑量(mg/d)=5.604 4-0.261 4×年齡+0.008 7×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)-0.867 7×VKORC1 A/G-1.697 4×VKORC1 A/A-0.485 4×VKORC1基因型未知-0.521 1×CYP2C9*1/*2-0.935 7× CYP2C9*1/*3-1.061 6×CYP2C9*2/*2-1.920 6×CYP2C9*2/*3-2.331 2×CYP2C9 *3/*3-0.218 8×CYP2C9基因型未知-0.109 2×亞洲人-0.276 0×非洲人-0.103 2 ×未知人種+1.181 6×酶誘導劑-0.550 3×胺碘酮。式中年齡以十進制計算，即1代表10～19歲，2代表20～29歲，3代表30～39歲，依此類推。如果服用卡馬西平、苯妥英、利福平等酶誘導劑，就為1，其它則為0。

2.WEN模型中國臺灣的WEN等[5]首先根據CYP2C9與VKORC1的基因型制定了華法林的起始劑量，見表3。然后再根據年齡、體表面積(body surface area，BSA)及預測劑量建立了穩定劑量預測模型。公式:劑量(mg/d)=0.432+ 0.769×預測劑量(mg/d)-0.015×年齡(歲)+ 1.125×BSA(m2)。BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)-0.152 9。

表3 華法林起始劑量預測表(中國人群)

3.HUANG模型HUANG等[6]搜集了266例中國患者標本，通過回歸分析建立了預測模型。模型公式:劑量(mg/d)=exp[0.727-0.007×年齡(歲)+0.384×BSA+0.403×(VKORC1 6484TC)+0.554×(VKORC1 6484CC)-0.482× (CYP2C9*1/*3)-1.583×(CYP2C9*3/*3)。式中BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)-0.152 9;VKORC1 6484 TC、VKORC1 6484 CC、CYP2C9*1/*3及CYP2C9*3/*3如果存在就乘以1，不存在則乘以0。

4.OHNO模型日本OHNO等[7]搜集了125例患者標本，經統計學分析得到以下模型:劑量(mg/d)=4.248×(VKORC1-1639GG)+ 1.067×(VKORC1-1639GA)-2.416×(CYP2C9 *3/*3)-0.864×(CYP2C9*1/*3)+1.308 ×BSA-0.025×[年齡(歲)]+2.263。式中BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×體重(kg)-0.152 9;VKORC1 6484 TC、VKORC1 6484 CC、CYP2C9*1/*3及CYP2C9*3/*3如果存在就乘以1，不存在則乘以0。

六、模型預測準確性評價指標

將所有入組患者臨床和基因型資料輸入各個預測模型公式進行計算預測劑量。VKORC1-1639G＞A和VKORC1-1173C＞T幾乎完全連鎖，因此將VKORC1-1173C＞T基因型結果作為所有公式中VKORC1結果。上海人群CYP2C9*2幾乎缺失，因此如果公式里含有CYP2C9*2則計為0。采用2項指標評價各模型預測準確性:(1)絕對誤差均值(mean absolute error，MAE)，為預測值減去實際值的均值;(2)決定系數(coefficient of determination，R2)，R為Pearson相關系數，可通過計算預測劑量與臨床實際劑量的相關性獲得。

為了驗證計算公式的臨床有效性，采用預測百分比進行計算:

理想預測(%)=(預測劑量介于實際劑量± 20%的患者數)/總患者數×100%。

高估預測(%)=(預測劑量＞實際劑量120%的患者數)/總患者數×100%。

低估預測(%)=(預測劑量＜實際劑量80%的患者數)/總患者數×100%。

如果模型對總體患者理想預測百分比≥40%，則進一步對其進行敏感性分析，即分析該模型對實際低、中、高劑量患者預測準確性。由于本院在臨床上常采用加減0.25片(2.5 mg/片)華法林調整劑量，因此將低、高劑量劃分閾值設為1.88 mg/d (即0.75片/d)和4.38 mg/d(即1.75片/d)。

七、統計學方法

結果

一、基因型分布

198例患者中VKORC1-1173T＞C位點TT型164例、CT型32例、CC型2例，T等位基因頻率為90.9%、C等位基因頻率為9.1%，見表4;與已發表的中國人群頻率分布一致。CYP2C9*3的野生型*1/*1(AA)183例、雜合突變型*1/*3 (CA)15例、純合突變型*3/*3(CC)0例，*1等位基因頻率為96.2%，*3頻率為4.8%，與已發表的中國人群頻率分布[6，8]基本一致。χ2檢驗表明2個基因均符合Hardy-Weiberg平衡。

二、基因型與華法林穩定維持劑量關系

VKORC1-1173TT基因TT型、CT型和CC型患者華法林平均穩定劑量分別為(2.60± 0.90)mg/d、(3.71±1.46)mg/d、4.00 mg/d，3種基因型之間差異均有統計學意義(P＜0.01)。CYP2C9*3基因*1/*1(AA)型和*1/*3 (CA)型患者華法林平均穩定劑量分別為(2.84± 1.12)mg/d和(2.34±0.83)mg/d，2種基因型之間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表5。

4個已發表模型及固定劑量方案對198例患者的預測準確性見表5。HUANG、OHNO和WEN 3個模型計算的MAE＜±1.0 mg/d，理想預測百分比＞40%，其MAE分別為0.73、0.74和0.78 mg/d，理想預測百分比分別為41.9%、42.4%和40.9%。大部分模型計算的低估預測百分比＜高估預測百分比，說明這些模型更容易高估穩定劑量。

表4 不同基因型與華法林劑量的關系

表5 各模型預測準確性比較

三、應用實例

患者邵某，男，58歲，身高160 cm，體重61 kg，未服用其它藥物，基因型為CYP2C9*3野生型*1 *1(AA)、VKORC1 1173 C＞T，按IWPC模型，年齡為×5(即58歲)，代入身高、體重，基因型中除VKORC1 A/G(與VKORC1 C/T相關)與亞洲人×1外，其余均為×0，結果劑量(mg/d)=5.604 4-0.261 4×5+0.008 7×160+0.012 8×61-0.867 7 ×1-1.697 4×0-0.485 4×0-0.521 1×0-0.935 7×0-1.061 6×0-1.920 6×0-2.331 2×0 -0.218 8×0-0.109 2×1-0.276 0×0-0.103 2×0+1.181 6×0-0.550 3×0=5.493 3 mg。而實際收集的資料表明穩定劑量為5 mg/d，因此高估+0.493 3 mg，＜1 mg，同時測定患者的INR為1.91。

討論

目前，臨床上華法林的給藥方案通常是首先給予一定標準劑量(中國患者多為2.5 mg/d或3.0mg/d，歐美患者多為5.0mg/d或10.0 mg/d)，臨床醫生根據患者定期監測的INR值的情況，增加或減少劑量，直至INR達到靶標(2～3)[8-9]。但在藥物劑量調整過程中，患者要反復抽血進行INR監測，而且劑量調整的周期一般較長，患者也會有較高的發生血栓或出血的風險。而目前的研究顯示，某些基因的遺傳變異是造成個體間華法林維持劑量差異的主要原因[10]。

多項研究[11-10]表明，通過對各種因素的回顧性分析，可以得到華法林維持劑量的數學公式，用來預測個體的華法林劑量，從而減少華法林達到穩定劑量過程的時間及在此過程中可能出現的危險事件。目前已有多篇文獻報道[11-12]在臨床患者上驗證和比較了這些基因導向的預測模型，如有文獻[12]將目前報道的12個模型在中國人群中的效果進行了外部驗證，其中MAE最低的3個模型分別為GAGE、WEN和OHNO;理想預測百分比最高的3個模型分別為WEN、HUANG和GAGE。敏感性分析顯示預測模型對低劑量患者的預測準確性都較差。盡管這些模型具有潛在的應用價值，但是在臨床上推廣應用這些模型之前，很有必要先驗證這些模型對真實患者的預測準確性。在過去的幾年中，一些基因導向的華法林穩定劑量給藥模型得到了建立及驗證。本研究針對上海地區患者人群驗證了典型的4種華法林穩定劑量給藥模型的準確性。雖然IWPC模型是基于多中心多種族且建模樣本最大的一個模型，但其預測的準確性卻是4個模型中是最低的，這與以往的部分研究結果有些出入。之前有研究結果顯示IWPC模型顯示出較好的預測準確性[1，4]。原因可能是雖然其模型建立基于多中心多種族，且納入樣本最大，但另外3個模型的研究對象與本研究中的病患類似，均為基于亞洲人群建立，華法林的穩定劑量較白種人低，因此顯示出明顯的種族特性。本研究也發現模型本身的R2值(可解釋華法林劑量個體差異百分比)與模型的預測準確性無關。本研究理想預測百分比不高，可能原因是:(1)本研究納入的模型只包含VKORC1-1173C＞T和CYP2C9*3兩個基因，其它遺傳變異可能也會導致患者需要較低劑量的華法林，如CYP4F2突變等，近些年的研究表明此基因突變的多態性位點對華法林穩定劑量也有一定的影響[13-16]，能夠解釋一部分華法林穩定劑量的變異;(2)本研究未調查患者具體的飲食情況，上海地域患者可能在日常飲食中與其它地方的飲食習慣不同，可能服用導致INR升高的食物的量不同，如食用綠色蔬菜或富含維生素K飲食的減少會降低維生素K的攝取，從而增加華法林的抗凝效應[17]。本研究結果顯示VKORC1-1173TT基因型、CT型和CC型患者之間華法林平均穩定劑量差異均有統計學意義(P＜0.01)，兩兩比較差異亦有統計學意義(P＜0.05)。CYP2C9*3基因* 1/*1(AA)和*1/*3(CA)患者之間華法林平均穩定劑量差異有統計學意義(P＜0.05)。針對亞洲人群建立的3個穩定劑量預測模型優于IWPC模型，但由于各地人群飲食等生活習慣不同，3個穩定劑量預測模型對于上海人群的預測效果仍然不是十分理想。因此，建立適合于上海人群的華法林穩定劑量預測模型還是有必要的[3]。

綜上所述，華法林穩定劑量個體差異受多種遺傳因素和非遺傳因素影響，基于VKORC1和CYP2C9基因型構建的華法林劑量預測模型可以較好地預測部分患者，具有一定的臨床應用價值。但本研究結果顯示，此類劑量預測模型對預測人群有一定種族、地域特異性，在臨床普遍推廣使用這些模型之前，應結合模型性質及患者特征，選擇及建立最合適的模型，并且需要進行更多前瞻性的研究檢驗這些模型。

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Evaluation on the stable dose prediction accuracy of Warfarin anticoagulant therapy by pharmacogenetics among Shanghai patients

ZHUANG Wenfang，CHEN Yanhong，LUO Ruiping，WU Jing，XUAN Binbin，CAO Yanan，YANG Li，SHENG Huiming.(Department of Clinical Laboratory，Tongren Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200335，China)

ObjectiveTo validate the stable dose prediction accuracy of Warfarin anticoagulant therapy by pharmacogenetics among Shanghai patients with pulmonary embolism and heart fibrillation.MethodsThe complete clinical data of 198 patients with stable Warfarin dose were collected.The VKORC1-1173C＞T，CYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotypes were detected by polymerase chain reaction-high resolution melting technique after whole blood genomic DNA extraction with peripheral blood 1.8 mL of sodium citrate anticoagulation 1∶9.The 4 prediction algorithms，including IWPC for mixed population，WEN for Chinese Taiwan population，HUANG for Chinese mainland population and OHNO for Japanese，were evaluated and compared by mean absolute error(MAE)and prediction accuracy.ResultsThe MAE of HUANG，OHNO and WEN in 4 prediction algorithms and fixed dose model was＜±1.0 mg/d with ideal prediction percentage＞40%，with the minimum MAE in HUANG.The ideal prediction algorithm with highest percentage was OHNO.ConclusionsThe Warfarin stable dose algorithms by pharmacogenetics for Asian population combined with basic clinical information can predict the dose of Warfarin among Shanghai with clinical application significance.

Warfarin;Genotype;Pharmacogenetics;Dose prediction algorithm;CYP2C9;VKORC1

1673-8640(2015)07-0697-06

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.008

2014-10-19)

(本文編輯:范基農)

上海市長寧區科委重點項目(CNKW2013Z02)

莊文芳，女，1968年生，學士，副主任技師，主要從事血液學檢驗工作。

盛慧明，聯系電話:021-62909911-1220。