線性探針法與傳統藥敏法篩查耐多藥肺結核符合性的研究

劉 然， 郭春梅， 劉佃香， 李玉梅

(大慶市第二醫院檢驗科，黑龍江大慶1634610)

在防治肺結核的工作中，由于患者不規范治療的原因，造成耐藥肺結核的問題非常嚴重。中國耐多藥結核病疫情居高不下，耐藥性結核病的產生在很大的程度上影響了結核病治療的療效，尤其耐多藥結核病(multidrug resistance tuberculosis，MDRTB)已成為當前結核病防治中的一個難題［1］，也是結核病患者死亡的最大殺手，所以早期能夠及時、快速地對結核病耐藥性進行檢測，讓患者得到科學治療十分重要。目前肺結核耐藥性主要靠細菌學檢查(包括細菌培養、菌種鑒定與藥物敏感試驗)，由于結核分枝桿菌生長緩慢，整個培養、菌種鑒定加上藥物敏感試驗時間最快也要2個月，不能有效指導臨床治療同時也加大了病原菌傳播機會。由此可見，尋找快速的檢測方法意義重大。我們采用線性探針法用于快速篩查耐多藥肺結核，只需要2 d時間［2］，就可以檢測出利福平和異煙肼耐藥的涂片陽性肺結核患者。

一、材料和方法

1.標本來源 大慶市第二醫院2014年5月至2014年12月收治的明確診斷為肺結核住院患者。結核分枝桿菌涂片陽性標本86份;結核分枝桿菌傳統羅氏培養陽性30份。

2.主要儀器與試劑 珠海貝索生物技術有限公司生產的改良L-J培養基及含藥培養基;HAIN結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統［3］;GenoType MTBDRplus試劑盒購自德國Hain公司。

3.傳統藥敏試驗 用傳統改良L-J培養基檢測對利福平、異煙肼等抗結核藥物的敏感性。使用藥物最終濃度分別為利福平40.0μg/mL、異煙肼0.2μg/mL。按照全國臨床檢驗操作規程操作要求用接種環刮取改良L-J培養基表面的菌落，以0.5%Tween 80生理鹽水磨菌配成1 mg/mL的菌液，進行100倍稀釋。混勻后取菌液0.1mL，均勻地接種于培養基斜面上，每1種藥物接種2支培養基，同時接種0.1mL于不含藥的培養基，每周觀察1次，至4周報告結果。

4.線性探針法檢測 (1)對涂片陽性標本的檢測:使用堿處理-中和離心沉淀法對痰標本進行前消化處理。0.1mL接種改良L-J培養基，37℃培養。取經前消化處理后的痰標本按照分子線性探針雜交，嚴格按照GenoType MTBDR說明書要求操作，檢測流程包括目的基因片段的擴增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot40專用程序)、結果判讀;(2)對陽性培養物檢測:將從羅氏培養基上刮取一接種環結核分枝桿菌混勻于裝有200μL雙蒸水的1.5 mL離心管中，95℃金屬浴滅活30 min。用基因提取試劑盒提取結核分枝桿菌核酸，再進行基因片段的擴增、反向雜交膜顯色(使用GenoTypeHot30專用程序)、結果判讀。

5.判讀標準(參照試劑盒說明書)(1)肉眼觀察雜交條帶顯色情況，只有那些與擴增指控帶(AC)強度相同或更強的條帶才可判斷為陽性;條帶上的標記物質控(CC)、AC、結核分枝桿菌復合群及位點質控(rpoB、KatG、inhA)需全部陽性，結果方可進行判讀，否則為無效結果;(2)野生型探針:所有野生型探針條帶陽性，表示檢測區沒有發生可檢出的突變，試驗菌株對各自抗菌藥物敏感;如果至少有1個野生型探針信號缺失，則表示試驗菌株對相應的抗菌藥物耐藥;如果rpoB野生型探針信號缺失，則可得出試驗菌株對利福平耐藥的結論;如果KatG野生型探針缺失，則可得出試驗菌株對高水平異煙肼耐藥的結論，如果inhA野生型探針缺失，則可得出試驗菌株對低水平異煙肼耐藥性的結論;(3)突變探針:如果rpoB突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對利福平耐藥的結論;如果KatG突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對高水平異煙肼耐藥的結論，如果inhA突變型探針信號陽性，則可得出試驗菌株對低水平異煙肼耐藥性的結論。

二、結果

1.對86份結核分枝桿菌涂片陽性標本進行分析。結果顯示利福平單耐藥2種方法的符合率為95.6%，見表1。

表1 86份結核分枝桿菌涂片陽性標本分析

2.采用傳統藥敏試驗和線性探針法同時對30份結核分枝桿菌陽性培養物進行分析。結果顯示利福平單耐藥、異煙肼單耐藥及二者同時耐藥的符合率均為100%。見表2。

表2 30份結核分枝桿菌陽性培養物分析

3.對86份結核分枝桿菌涂片陽性標本分別采用傳統培養和線性探針方法檢測分析。發現用傳統培養法結核分枝桿菌陽性84份，陽性符合率97.6%，而用線性探針法則結核分枝桿菌陽性86份，陽性符合率達100%。

4.對30份結核分枝桿菌培養陽性物進行線性探針方法檢測，結核分枝桿菌復合群均為陽性，符合率為100%(30/30)。

三、討論

線性探針法的主要原理是在標本中提取核酸DNA、用生物素標記的引物進行多重聚合酶鏈反應擴增和反向雜交。通過檢測RPOB基因突變(編碼還原型輔酶Ⅰ聚合酶B-亞單位)確定對利福平的耐藥性［4］;通過檢測KATG基因(編碼過氧化氫酶)和INHA基因的啟動子區(編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶)確定對異煙肼的耐藥性［5-6］。

傳統藥敏試驗是檢測藥物耐藥性的金標準，但檢測時間太長。通過對線性探針法、傳統藥敏法檢測利福平和異煙肼耐藥符合性的研究，耐藥結果符合率達到了100%。線性探針法快速篩查耐多藥肺結核，只需要2 d時間。本研究結果顯示，對結核桿菌涂片陽性標本直接采用線性探針方法篩查耐多藥肺結核，既快速又準確，能快速為臨床提供耐多藥肺結核的耐藥檢測結果，讓患者得到及時科學治療，臨床意義重大。

［1］中華人民共和國衛生部.全國結核病耐藥性基線調查報告(2007-2008)［M］.北京:人民衛生出版社，2010:1-3.

［2］單萬水，單金嵐，詹能勇，等.DNA芯片快速檢測耐利福平結核分枝桿菌rpoB基因突變［J］.中華檢驗醫學雜志，2003，26(11):680-682.

［3］中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室.線性探針耐藥性檢測方法應用評估實施細則［S］.北京:中國疾病預防控制中心，2010:37-47.

［4］MILLER LP，CRAWFORD JT，SHINNICK TM.The rpoB gene of Mycobacterium tuloercubsis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38(4):805-811.

［5］MANI C，SELVAKUMAR N，NARAYANAN S，etal.Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India［J］.JClin Microbiol，2001，39(8):2987-2990.

［6］VILCHèZE C，WEISBROD TR，CHEN B，etal.Altered NADH/NAD+ratio mediates coresistance to isoniazid and ethionamide in mycobacteria［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):708-720.