陰溝腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因分布

唐翠連，王芳，陳芳軍，張文斌

(1.湖南邵陽醫學高等專科學校附屬醫院，湖南邵陽422000;2.湖南邵陽新寧縣人民醫院，湖南邵陽422000; 3.湖南邵陽武岡市人民醫院，湖南邵陽422000;4.湖南邵陽縣人民醫院，湖南邵陽422000)

陰溝腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因分布

唐翠連1，王芳2，陳芳軍3，張文斌4

(1.湖南邵陽醫學高等專科學校附屬醫院，湖南邵陽422000;2.湖南邵陽新寧縣人民醫院，湖南邵陽422000; 3.湖南邵陽武岡市人民醫院，湖南邵陽422000;4.湖南邵陽縣人民醫院，湖南邵陽422000)

目的了解湖南邵陽地區耐氨基糖苷類抗菌藥物的陰溝腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因分布特點及其與氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性的關系。方法收集2012年8月至2014年5月邵陽地區新寧縣人民醫院、武崗市人民醫院、邵陽縣人民醫院和邵陽醫學高等專科學校附屬醫院臨床樣本中分離的241株陰溝腸桿菌，采用API20E進行菌種鑒定，同時用紙片擴散法進行體外藥物敏感性試驗。采用聚合酶鏈反應(PCR)進行armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD基因檢測，分析耐藥基因與耐藥表型的關系。結果241株陰溝腸桿菌中200株對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，其耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%。基因檢測結果提示，241株陰溝腸桿菌檢出2種16S rRNA甲基化酶基因，分別為armA(96株，39.8%)和rmtB(17株，7.1%)，未檢出npmA、rmtA、rmtC和rmtD基因。結論16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性有相關性。不同地區分離的對氨基糖苷類藥物耐藥的陰溝腸桿菌菌株攜帶16S rRNA甲基化酶的基因型有一定差異，湖南邵陽地區陰溝腸桿菌以攜帶armA基因為主。

陰溝腸桿菌;16S rRNA甲基化酶;耐藥性

陰溝腸桿菌是腸桿菌科中具有代表性的細菌之一，近年來在臨床其分離率呈現上升趨勢，僅次于大腸埃希菌，可從多種類型的標本分離獲得，已經成為本地區醫院感染的重要病原菌之一。氨基糖苷類藥物是具有氨基糖和氨基環醇結構的一類抗菌藥物[1]，臨床上主要用于治療包括陰溝腸桿菌在內的敏感革蘭陰性桿菌所引起的感染。由于該類抗菌藥物的廣泛應用，臨床上分離出的耐氨基糖苷類抗菌藥物的陰溝腸桿菌陽性率不斷增加，其主要原因為產氨基糖苷類修飾酶、細菌16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷類作用靶位16S rRNA基因突變及核糖體蛋白編碼基因突變[2]。本研究側重分析其他地區已有報道的armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD 6種16S rRNA甲基化酶基因在陰溝腸桿菌中的分布。

材料和方法

一、菌株來源

241株來自邵陽地區新寧縣人民醫院、武崗市人民醫院、邵陽縣人民醫院和邵陽醫學高等專科學校附屬醫院2012年8月至2014年5月臨床分離的非重復菌株。質控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

二、儀器與試劑

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(英國HYBAID公司);GDS-8000凝膠成像系統(美國UVP公司)。水解酪蛋白胨培養基、藥物敏感性紙片(英國OXOID公司);16S rRNA甲基化酶基因引物(上海生工生物工程技術有限公司);MasterMixPCR擴增試劑(北京天根生化科技有限公司)。

三、細菌鑒定

采用法國生物梅里埃公司生產的API20E對241株細菌進行再次鑒定。

四、體外藥物敏感性試驗

運用紙片擴散法對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素和奈替米星進行體外藥物敏感性試驗。

五、耐藥基因檢測

1.DNA提取采用蛋白酶K消化法制備DNA擴增模板。

2.16S rRNA甲基化酶基因PCR擴增16S rRNA甲基化酶基因引物序列參照文獻[3-4]設計，由上海生工生物工程技術有限公司合成。引物序列見表1。PCR擴增反應體系為25 μL，包括13 μL MIX、7 μL H2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL DNA模板。PCR擴增條件:95℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸5 min。用英國HYBAID擴增儀擴增，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，SYBR Green染色，凝膠成像儀觀察結果并照相。

3.產物測序及分析對擴增陽性的16S rRNA甲基化酶基因PCR產物經純化后由上海生工生物工程技術有限公司應用ABI 3700自動序列分析儀進行測序，測序結果登陸網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對分析。

表1 16S rRNA甲基化酶PCR擴增引物序列

結果

一、藥物敏感性試驗

241株陰溝腸桿菌中200株對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物呈現1種或數種不等的耐藥，41株對4種氨基糖苷類抗菌藥物均敏感。對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星4種氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，其中對阿米卡星的耐藥率最低。見表2。

表2 241株陰溝腸桿菌對4種氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性[例(%)]

二、耐藥基因檢測

241株陰溝腸桿菌中檢出2種16S rRNA甲基化酶基因，分別為armA(96株，39.8%)、rmtB (17株，7.1%)，其中有3株同時檢出2種基因型。這2種基因的檢出或缺失與菌株對氨基糖苷類抗菌藥物體外藥物敏感性試驗結果進行一致性比較，結果見表3。圖1、圖2分別為部分菌株armA、rmtB基因PCR產物電泳圖。

表3 241株陰溝腸桿菌的16S rRNA甲基化酶耐藥基因與其對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥表型相關性比較

圖1 armA基因PCR產物電泳圖

圖2 rmtB基因PCR產物電泳圖

討論

國家的細菌耐藥性監測數據顯示，陰溝腸桿菌的耐藥率逐年上升。深入了解陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥機制對于控制耐藥菌株的流行和播散及合理使用抗菌藥物具有重要意義。16S rRNA甲基化酶是細菌適應生存環境的一種能力，它能將細菌細胞16S rRNA解碼區A位點上的特定核苷酸進行甲基化處理，阻礙氨基糖苷類抗菌藥物結合到30S核糖體亞基上，從而導致細菌對該類抗菌藥物產生耐藥[5]。曾有研究顯示該酶能在人和動物之間播散[6]。

本研究發現湖南邵陽地區臨床分離的陰溝腸桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性較強，對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星的耐藥率分別為41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，應引起臨床高度重視。

質粒編碼的16S rRNA甲基化酶介導氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，已經在不同地區有所報道。浙江省臺州地區研究數據顯示16S rRNA甲基化酶基因型流行以rmtB為主[7]，昆明市延安醫院產超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)革蘭陰性腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因的攜帶率約為10%[8]。而本次研究采用PCR對湖南邵陽地區臨床分離的241株陰溝腸桿菌進行16S rRNA甲基化酶基因檢測，檢出2種16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtB)，以armA(39.8%)耐藥基因介導為主。16S rRNA甲基化酶基因的攜帶對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性有較高的陽性預測值(＞90%)，顯然這些耐藥基因的存在與該菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性密切相關。在本次調查中，多數菌株耐藥表型與基因型結果相一致，但也有個別菌株有差異，如有2株armA基因陽性而表型為敏感，1株rmtB基因陽性而表型為敏感，這有待于進一步研究;104株表型耐藥而未檢出甲基化酶基因，我們分析可能存在其他的耐藥機制。相關研究顯示，不同地區分離的對氨基糖苷類藥物耐藥的細菌16S rRNA甲基化酶基因型有一定的差異。本次調查在陰溝腸桿菌中發現armA基因為本地區的首次報道。

[1]孫艷，王沭，邵曉迪，等.頭孢拉宗與兩種氨基糖苷類抗菌藥物聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌的聯合藥敏研究[J].中國藥物應用與監測，2013，10(2): 75-78.

[2]蔡培泉，過毅.陰溝腸桿菌耐藥相關基因國內5年(2003-2007)研究進展[J].世界感染雜志，2008，8 (4):260.

[3]YOKOYAMAK，DOIY，YAMANEK，etal.Acquisition of 16S rRNA methylase gene in Pseudomonas aeruginosa[J].Lancet，2003，362(9399):1888-1893.

[4]MA L，LIN CJ，CHEN JH，et al.Widespread dissemination of aminoglycoside resistance genes armA and rmtB in Klebsiella pneumoniae isolates in Taiwan producingCTX-M-typeextended-spectrumbetalactamases[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53(l):104-111.

[5]DOI Y，ARAKAWA Y.16S ribosomal RNA methylation: emerging resistance mechanism against aminoglycosides[J].Clin Infect Dis，2007，45(1):88-94.

[6]陳琳，陳杖榴，劉健華.氨基糖苷類藥物耐藥新機制——16S rRNA甲基化酶的研究進展[J].中國獸醫科學，2006，36(11):935-939.

[7]周勇，張春玲，陳文舉，等.16S rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌中流行情況調查[J].中國預防醫學雜志，2013，14(12):933-935.

[8]高輝，王楊，黃云昆，等.16S rRNA甲基化酶基因在產ESBLs腸桿菌科細菌中的分布[J].檢驗醫學，2013，28(9):775-779.

Distribution of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae

TANG Cuilian1，WANG Fang2，CHEN Fangjun3，ZHANG Wenbin4.(1.The Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，Hunan Shaoyang 422000，China; 2.The People's Hospital of Xinning County，Hunan Shaoyang 422000，China;3.The People's Hospital of Wugang，Hunan Shaoyang 422000，China;4.The People's Hospital of Shaoyang County，Hunan Shaoyang 422000，China)

ObjectiveTo know the distribution characteristics of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae being resistant to aminoglycoside antibiotics and the relationship between 16S rRNA methylase gene and aminoglycoside drug resistance in Shaoyang，Hunan.MethodsA total of 241 isolates of Enterobacter cloacae were collected from the Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，the People's Hospital of Xinning County，the People's Hospital of Wugang and the People's Hospital of Shaoyang County from August 2012 to May 2014，and were identified by API20E.The drug sensitivity test in vitro was performed by K-B method.The armA，npmA，rmtA，rmtB，rmtC and rmtD genes were determined by polymerase chain reaction(PCR).The relation between drug resistant gene and resistant phenotypes was analyzed.ResultsIn the 241 isolates of Enterobacter cloacae，200 isolotes of them were resistant to aminoglycoside antibiotics，including 41.9%isolates being resistant to amikacin，68.5%to gentamicin，70.1%to tobramycin，and 63.5%to netilmicin.Two kinds of 16S rRNA methylase genes were detected，among which were armA(96 isolates，39.8%)and rmtB(17 isolates，7.1%)，and no npmA，rmtA，rmtC and rmtD genes were detected.Conclusions16S rRNA methylase is closely related with the drug resistance of aminoglycoside antibiotics.Genotypes carried by 16S rRNA methylases are somewhat different in bacterial isolates from different areas，and armA is a main kind of 16S rRNA methylase gene in Shaoyang.

Enterobacter cloacae;16S rRNA methylase;Drug resistance

1673-8640(2015)07-0691-03

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.006

2014-07-07)

(本文編輯:姜敏)

湖南省教育廳科研項目(12C1219);湖南邵陽市科技局科研項目(J1212)

唐翠連，女，1978年生，學士，副主任技師，主要從事微生物學檢驗研究。